解淀粉芽孢桿菌發酵豆腐工藝條件優化及營養功能研究

吳 珊 閆巧娟 駱 珅 劉 宏 楊紹青 江正強 劉 軍

(中國農業大學工學院1,北京 100083)(中國農業大學食品科學與營養工程學院2，北京 100083)

心腦血管疾病是一組高發病率、高致死率、高致殘率的慢性疾病。據世界衛生組織統計，2015年由心腦血管疾病引起的死亡人數占全球總死亡人數的31%，心腦血管疾病嚴重危害人類健康與生命[1]。在我國心腦血管疾病發病率極高且死于心腦血管疾病的人數比例不斷上升[2]。血栓的形成是造成心腦血管疾病病發的重要環節，可導致中風、心肌梗塞等疾病[1]。心腦血管疾病的常用溶栓藥物大多存在引起出血并發癥、價格昂貴等問題[3]。

芽孢桿菌屬是重要的產纖溶酶微生物，其中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌作為GRAS安全菌株被廣泛應用于中國豆豉、韓國豆醬、印尼Kinema及日本納豆等發酵食品的生產[4-6]。研究表明，由納豆菌(Bacillusnatto)發酵制得納豆營養豐富，具有抗血栓、抗氧化、降血壓等功能，被認為是日本人長壽的“秘密”[7]。近年，采用納豆發酵工藝開發新型食品的研究日益增多。Wei等[8]采用解淀粉芽孢桿菌發酵鷹嘴豆，在最優發酵條件下產纖溶酶活性達39.2 FU/g，且發酵鷹嘴豆的抗凝血活性和抗氧化作用較未發酵前均有提升。Feng等[9]采用枯草芽孢桿菌發酵木豆，纖溶酶活性達53.0 FU/g。

豆腐是大豆蛋白膠凝的產物[10]，其蛋白質豐富，口感細嫩，是獲取優質蛋白的良好來源。由于豆腐中飽和脂肪酸含量低等優點，其在西方國家也逐漸受到歡迎[11]。然而，豆腐因其高水分和高營養性，易腐敗變質，貨架期較短[10]。為了改善豆腐的風味、應用及商業價值，豆腐可制成炸豆腐、凍豆腐和發酵豆腐等加工食品[12]。發酵可提高食物的保存性，還能增強原料的抗氧化、抗肥胖、抗菌等生物活性。目前，國內外消費人群較大的發酵豆腐產品有中國腐乳、臭豆腐，日本Tofuyo和馬來西亞Tau ju等。發酵豆腐生產過程中需要較高鹽分(4%～14%)以抑制有害微生物生長，且發酵周期較長，一般為3～6個月[13]。近年來，采用乳酸菌、蘑菇真菌、泡菜菌等微生物發酵豆腐，獲得新型低鹽、高營養發酵豆腐日益受到關注[14-16]。

本研究利用實驗室自行篩選得到的高產纖溶酶活性解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐，通過單因素實驗優化發酵條件，對具有纖溶酶活性發酵豆腐的營養成分、抗血栓活性及DPPH自由基清除活性進行分析，探討了發酵豆腐功能活性與營養成分變化的相關性，為開發具有血栓性心腦血管疾病防治作用的發酵豆腐食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

豆腐：市售。

凝血酶(Sigma-T4648, 1KU)、纖維蛋白原(Sigma-F8630, 65%～85% protein)、Gly-Leu(Sigma-G2002)；胰蛋白胨、酵母提取物；肝素鈉、福林酚試劑；其他試劑無特殊說明均為分析純。

解淀粉芽孢桿菌 CAUNDJ118保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，16050)。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外可見分光光度計；TYAIB 立式壓力蒸汽滅菌鍋；HZQ-F160 全溫振蕩培養箱；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺；L-8800型氨基酸自動分析儀；GC-2010氣相色譜儀；Thermo ScientificTMMultiskan FC酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 發酵豆腐制備

稱取豆腐2 000 g，切成20 mm×20 mm×20 mm方塊，放入45 ℃烘箱烘至含水量為60%，置于121 ℃滅菌鍋中蒸煮20 min，降溫至40 ℃后接種菌液，置于37 ℃培養箱中發酵72 h。發酵過程中分別在0、6、9、12、24、30、36、48、72 h取樣，樣品冷凍干燥后粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 發酵條件優化

考察初始水分(50%～75%)、菌液濃度(105～1010CFU/mL)、接菌量(2%～18%)及發酵時間(0～72 h)對發酵豆腐產纖溶酶活性的影響。

1.3.3 水解氨基酸及游離氨基酸組成的測定

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[17]。

1.3.4 脂肪酸組成的測定

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[18]。

1.3.5 還原糖、總酚含量和多肽含量的測定

準確稱量1.0 g凍干樣品分散于20 mL蒸餾水中，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，離心(10 000r/min，10 min)取上清液。參照福林(Folin)-酚試劑法測定上清中總酚含量[11]，以沒食子酸為標準品制作標準曲線。采用鄰苯二甲醛法測定上清中多肽含量[19]，以Gly-Leu二肽為標準品制作標準曲線。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定上清中還原糖含量[20]，以葡萄糖為標準品制作標準曲線。

1.3.6 纖溶酶活性的測定[9]

將凍干樣品按1∶10(m/V)加入生理鹽水，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，離心(10 000 r/min，10 min)取上清液。分別取1.4 mL硼砂緩沖液(50 mmol/L，pH 8.5)和0.4 mL纖維蛋白原溶液(0.72%，m/V)，混合后于37 ℃預熱5 min，加入0.1 mL凝血酶溶液(20 U/mL)于37 ℃水浴中反應10 min。加入適當稀釋后樣品上清液0.1 mL，于37 ℃水浴中繼續反應60 min，加入0.2 mol/L 三氯乙酸溶液2 mL終止反應，37 ℃靜置20 min，10 000 r/min離心10 min取上清液，275 nm波長條件下測定吸光值。對照樣品先加入三氯乙酸后再加入樣品上清液。纖溶酶酶活定義：每分鐘275 nm處吸光度增加0.01所需酶量定義為1個單位的纖維蛋白降解酶活力(FU)。

(1)

式中：X為樣品的酶活力/FU/mL；Ar為樣品吸光值；Ac為對照吸光值； 60為反應時間60 min；0.1為參加反應的樣品上清液體積0.1 mL；N為稀釋倍數。

1.3.7 抗凝血活性的測定[21]

采用50 mM Tris-HCl 7.2緩沖液(含0.12 mmol/L NaCl)溶解稀釋牛纖維蛋白原、牛凝血酶和待測樣品上清液。在96孔板中依次加入140 μL0.1%纖維蛋白原和40 μL樣品上清液，于405 nm下測定吸光度值Asb(Acb)，5 min后加入10 μL 12 U/mL凝血酶，于37 ℃反應10 min，于405 nm下測定吸光度值As(Ac)。

(2)

1.3.8 DPPH自由基清除活性的測定

參照Sritongtae等[20]的方法測定發酵豆腐樣品DPPH自由基清除活性。將DPPH溶解于無水乙醇中配制成0.5 mmol/L的DPPH溶液。向含有140 μL樣品上清液的96孔板中加入140 μL DPPH溶液(0.5 mmol/L)，混合均勻后避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度值(A1)。以140 μL樣品上清液和140 μL無水乙醇混合后的吸光度值(A2)為對照, 以140 μL無水乙醇和140 μL DPPH溶液混合后的吸光度值(A3)為空白。以水溶性維生素E(Trolox)為標準品制作標準曲線，DPPH自由基清除活性采用μmol trolox/g dw表示。

1.4 統計分析

所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS20.0軟件進行Duncan’s multiple range test分析，P<0.05表示各組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐條件優化

發酵條件對菌株CAUNDJ118發酵豆腐產纖溶酶活性的影響如圖1所示。隨著初始水分的升高，發酵豆腐的纖溶酶活性隨之升高。當初始水分為60%時，纖溶酶活性達到最大值51.5 FU/g；菌液濃度對發酵豆腐產纖溶酶活性的影響與初始水分相似，當初始水分為60%，接種量為6%，發酵時間24 h的條件下，CAUNDJ118菌液濃度 107CFU/mL制得發酵豆腐的纖溶活性達到最大值63.1 FU/g；當在初始水分為60%，發酵時間24 h，CAUNDJ118菌液濃度為 107CFU/mL，接種量為10%，制得發酵豆腐的纖溶酶活性最高為70.5 FU/g；隨著發酵時間的延長，發酵豆腐纖溶酶活性升高，當發酵時間為36 h，纖溶酶活性最高達到86.1 FU/g。

圖1 發酵時間、接種量、菌液濃度和初始水分對解淀粉芽孢桿菌發酵豆腐產纖溶酶活性的影響

目前，商業化納豆食品中纖溶酶活性一般在20～40 FU/g[22]，經發酵條件優化后，采用解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的纖溶酶活性達86.1 FU/g，顯著高于商業化納豆中纖溶酶活性水平。且解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐周期為36 h，與常見豆腐發酵食品相比發酵周期顯著縮短。此外，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐采用無鹽發酵，可避免食鹽對酶的抑制作用，同時還可充分發揮低鹽或無鹽大豆發酵食品在膳食營養中作用[23]。

2.2 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵對豆腐氨基酸組成的影響

未發酵豆腐和解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的總氨基酸組成如表1所示，未發酵和發酵豆腐中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量相對較高。與未發酵豆腐相比，經48 h發酵后豆腐中谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量顯著增加；而天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸以及總氨基酸含量均顯著降低。解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118在發酵豆腐過程中可利用和代謝氨基酸。Yang等[24]采用靈芝菌對豆乳進行發酵后，總氨基酸含量亦顯著降低[29]。

表1 未發酵豆腐與發酵豆腐的總氨基酸組成/mg/g

注：同列肩標小寫字母不同表示差異顯著，P<0.05；*為成年人必需氨基酸；&為抗氧化氨基酸，余同。

對豆腐發酵前后游離氨基酸組成分析發現，經解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵48 h后豆腐中游離氨基酸總含量為115.87 mg/g，顯著高于未發酵豆腐。發酵后豆腐的必需氨基酸含量顯著提高。CAUNDJ118發酵顯著影響豆腐中的抗氧化氨基酸的含量，抗氧化氨基酸中組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸的含量均顯著增加。發酵豆腐中纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量達到10 mg/g以上，分別占總游離氨基酸含量的9%、14%、10%、13%、13%和12%，游離氨基酸含量增加可能由于發酵過程中產生的蛋白酶或肽酶水解蛋白質或多肽降解成氨基酸[20]。

表2 未發酵豆腐與發酵豆腐的游離氨基酸組成/mg/g

注： LOQ為定量限。

2.3 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵對豆腐脂肪酸組成的影響

采用氣相色譜法從未發酵和發酵48 h的豆腐中鑒定出19種脂肪酸，飽和脂肪酸以C16∶0和C18∶0為主；不飽和脂肪酸則以C18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3為主；不飽和脂肪酸占總脂肪酸組成的80%以上，其中C18∶2n6c為主要脂肪酸組成。采用乳酸菌發酵豆腐時，未發酵和發酵豆腐中主要脂肪酸為C16∶0、18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3[25]。表3可見，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵可顯著增加飽和脂肪酸含量及不飽和脂肪酸含量，但發酵前后豆腐中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值(UFA/SFA)無顯著差異。UFA/SFA比值在0.6以上的食品有助于促進人類心血管健康[31]。在本研究中， CAUNDJ118發酵豆腐的UFA/SFA比值為4.85，符合聯合國糧食及農業組織FAO建議值[26]。因此，CAUNDJ118發酵豆腐是不飽和脂肪酸的良好食物來源，具有預防或改善心腦血管疾病的潛力。

表3 未發酵豆腐與發酵豆腐的脂肪酸組成/mg/g

2.4 豆腐發酵過程中總酚、多肽和還原糖含量的變化

酚類化合物因其潛在的健康功效引起廣泛關注。研究發現，采用枯草芽孢桿菌、kimchi和乳酸菌混合菌、Lentinusedodes或平菇菌等微生物菌株發酵豆腐，發酵后豆腐中總酚含量較發酵前增長1.1～2.5倍[15,16,27]。如表4所示，隨著發酵時間的延長，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐中總酚含量不斷上升，發酵48 h后總酚含量達到最高值，為13.1 mg GAE/g，增加了6.6倍。前期實驗中發現，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118能夠產生β-葡萄糖苷酶(未發表)。酚類化合物通常與糖相連以苷的形式存在，生物利用度較低。在發酵過程中，復雜的酚類物質可以被微生物分泌的β-葡萄糖苷酶作用，降解成為易吸收，高生物活性的可溶性酚類化合物[28,29]。多肽除具有蛋白質營養價值外，還有抗氧化、抗菌、降血壓、降糖等多種生理活性[30]，并且多肽相較于其他大分子活性組分，更易被腸道吸收[31]。解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐中多肽含量隨發酵時間的延長不斷增加，發酵48 h后多肽含量達到最高值，增加了32.8倍。發酵開始前12 h內，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐中還原糖含量無顯著變化，發酵36 h后發酵豆腐中還原糖含量達到最高值。CAUNDJ118發酵使得豆腐的還原糖含量增加了3.6倍，這可能是由于發酵過程中微生物所分泌的纖維素酶或淀粉酶的作用，將豆腐中的纖維素、淀粉等降解為低分子的還原糖[32]。

表4 CAUNDJ118發酵豆腐過程中總酚、多肽和還原糖含量的變化

注：dw為干質量。

2.5 豆腐發酵過程中DPPH自由基清除活性的變化

研究表明，豆腐的DPPH自由基清除活性較低，而經芽孢桿菌或真菌發酵可以顯著提高豆腐的抗氧化作用[15,16,27]。由圖2所示，隨著發酵時間延長，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的DPPH自由清除活性顯著增強，在發酵48 h達到最高值。與未發酵豆腐相比，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵48 h豆腐的DPPH自由基清除活性增加4.6倍。采用韓國kimchi和乳酸菌混合發酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加1.1倍[15]。采用2種蘑菇真菌Lentinusedodes和Pleurotusostreatusmycelia發酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2～4 倍[16]。采用枯草芽孢桿菌發酵凍干豆腐，48 h后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2.3倍[27]。經相關性分析發現，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的總酚含量和多肽含量與其DPPH自由清除活性呈正相關，相關系數R分別為0.98和0.99。

圖2 CAUNDJ118發酵豆腐過程中DPPH自由基清除活性和抗凝血活性的變化

2.6 豆腐發酵過程中抗凝血活性的變化

研究表明，豆腐發酵食品(中國豆腐乳、日本Tofuyo和泰國Taufuyee等)具有降血壓、抗氧化和抑菌等生理活性[30]。由圖2所示，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的抗凝血活性隨著發酵時間延長而顯著增強，且在發酵36 h達到最高值(97.9%，IC50=0.17 mg/mL)，優于陽性對照肝素鈉(IC50=0.55 mg/mL)繼續延長發酵時間對發酵豆腐的抗凝血活性無顯著影響。經解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵后豆腐具有較強的抗凝血活性，可見發酵過程中有抗凝血物質生成。相關性分析發現，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐纖溶酶活性與其抗凝血活性之間的相關系數R=0.98，呈顯著正相關。芽孢桿菌發酵黃豆可產生一種纖溶酶-納豆激酶，具有抗凝血活性[22]。解淀粉芽孢桿菌發酵鷹嘴豆的纖溶酶活性和抗凝血活性隨發酵時間的增加而增強，纖溶酶是其抗凝血活性的重要功效成分[8]。此外，研究發現乳酸菌、芽孢桿菌等細菌發酵過程中會生成抗凝血肽[33]。相關性分析發現，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發酵豆腐的多肽含量與其抗凝血活性的相關系數R=0.95，呈顯著正相關。

3 結論

采用解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118對豆腐進行無鹽發酵，經發酵條件優化后，發酵豆腐中游離氨基酸、脂肪酸、總酚、多肽及還原糖含量顯著提高，隨著發酵時間的延長，發酵豆腐的纖溶酶活性、DPPH自由基清除活性以及抗凝血活性顯著增強。相關性研究發現，發酵豆腐的DPPH自由基清除活性與其總酚和多肽含量呈正相關，而發酵豆腐的抗凝血活性與其纖溶酶活性及多肽含量呈正相關。