玉米醇溶蛋白復合納米粒子的組裝及穩定性研究進展

傅玉穎李澤亞 張 豪 陳國文 靳 冰 巴楚潔 張 超 李貞鵬

(浙江工商大學杭州商學院1，杭州 311508)(浙江工商大學食品與生物工程學院2，杭州 310018)

玉米醇溶蛋白(Zein)，舊稱米朊，是一種安全無毒的植物蛋白，已被FDA批準用于口服[1]。Zein分子中有3/4是親脂性氨基酸，決定了其固有的疏水性[2]。此外，食品質構感官和獨特的功能特性也取決于Zein的分子結構變化。Zein的兩親性氨基酸決定了其溶解度和結構的多變性，相分離(液-液分散、復凝聚、反溶劑沉淀)技術已被廣泛用于構建Zein納/微米粒子，已有研究指出Zein納米粒子在一定的酸堿度、高鹽濃度和熱處理條件下是不穩定的[3]，Patel等[4]使用Zein制備的膠體運載體系非常易于聚集，特別是在其等電點附近。利用Zein構建的復合納米粒子穩定性差、包封率低、凍干后受損，存在應用局限性。本文概述Zein的分子模型、自組裝機理以及近幾年Zein的各種改性技術(物理改性、化學改性、酶法改性和冷等離子體改性)等方面，為改善 Zein本身及造粒性質提供參考，拓展Zein在食品、醫藥和化妝品行業的應用。

1 Zein基本性質與結構

1.1 Zein的理化性質

Zein是一種混合蛋白，生物相容性強，可生物降解，能夠自組裝[5]，表1列舉了Zein的基本物理化學性質。Zein屬于一類分子質量不同的醇溶性多肽，根據溶解度和氨基酸序列的相似性，Zein被劃分為4個組成部分，即α-Zein (19 000和22 000)，β-Zein (14 000)，γ-Zein (16 000和27 000) 和δ-Zein (10 000)[8]，但這些蛋白分子質量會因不同的提取方法有所不同。在結構上，Zein主要由疏水和中性氨基酸組成僅含有少量的極性氨基酸殘基(如谷氨酰胺)[9]，Zein的氨基酸組成見表2，可以看出，疏水性氨基酸(如亮氨酸和丙氨酸)和酸性氨基酸(如谷酰胺)含量最高，因此Zein不溶于水(平均疏水力是白蛋白或纖維蛋白原的50倍)和稀鹽溶液，但溶于60%～95%乙醇，高濃度的尿素，堿性溶液(pH≥11)和陰離子表面活性劑溶液(如SDS溶液)[10]。

商品化的Zein有2種顏色，即黃玉米蛋白(亮黃色)和白玉米蛋白(白色)。黃玉米蛋白因為含有玉米黃素(8%～9%，由葉黃素，玉米黃質素，β-隱黃素組成)而呈現淡黃色，此類蛋白的純度通常為88%～90%，氧化程度隨儲藏時間延長而加深導致顏色變淡[11，12]。白色的Zein由黃玉米蛋白脫色得到，幾乎不含玉米黃素，純度一般在96%以上。研究表明，玉米黃素的存在與Zein的膠體性質密切相關，含有玉米黃素的Zein具有更好的界面吸附活性，賦予其更好的兩親特性，通過pH誘導脫除玉米黃素，發現Zein荷載姜黃素的能力明顯下降[13]。

表1 玉米醇溶蛋白的基本物理化學性質[6，7]

表2 玉米醇溶蛋白的氨基酸組成[6](g氨基酸/100 g玉米醇溶蛋白)

1.2 α-Zein的結構模型

研究表明，α-Zein是Zein的主要形式，具有大量α-螺旋，隨溫度、pH和溶劑組成等因素而變化[14]。Lee等[14]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到了Zein多肽2種主要的表觀分子質量為19 000和22 000(分別稱為Z19和Z22)，有研究提出Zein結構模型有阿螺旋輪模型[15]、長帶狀模型[16]、發夾模型[17]和開放的超螺旋模型[18]。

α-Zein由均一的重復單元組成，圖1展示了4種可能的α-Zein的三維結構模型。圖1 a是由Argos等[15]基于甲醇溶液中α-Zein的重復單元和α-螺旋含量分析提出的阿螺旋輪模型。在此模型中，9個相鄰的拓撲反平行螺旋形成了由谷氨酰胺殘基連接的圓柱形表面，此結構由范德華力和分子間氫鍵穩定，極性谷氨酰胺殘基通過側鏈間的相互作用促使分子間進一步堆積成平面。此模型提出了Zein的一個軸率為2∶1的球型自組裝結構，與Tatham等[19]提出的細長不對稱結構相反。Matsushima等[17]利用小角X射線散射(SAXS)研究了70%乙醇水溶液中Zein的構象特征，提出了由9～10個相鄰拓撲反平行螺旋組成的尺寸為13 nm×1.2 nm×3 nm，軸率為6∶1的長帶狀模型(圖1b)。二維的分子間疏水聚集使螺旋中伸出的側鏈堆積成一個疏水的表面，形成了一個兩端親水(頂部與底部)而側面疏水的結構，極大提高了α-Zein結構的穩定性。此帶狀模型常被用來解釋Zein在親水/疏水表面的取向行為與Zein自組裝成納米顆粒的行為過程[20-21]。但幾位研究者在這種混合物中進行的構象研究相互矛盾，可能是受到了遺傳或環境因素的影響。Forato等[18]通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)，核磁共振(NMR)和小角X射線散射(SAXS)分析了從BR451玉米品種中提取的Z19片段(無Z22蛋白)，發現Z19含有46%的α-螺旋和22%的β-折疊且不是緊湊結構，并由此將Z19結構建模為由螺旋形、片狀、轉彎形和二級結構組成的發夾狀，即短螺旋結構以延伸的方式排列，通過環、圈或片連接，符合13 nm × 1.2 nm × 3 nm的尺寸并且更穩定，區別于Tatham等[19]提出的在2個長螺旋節段的中間有1個轉彎或環(圖1c)，并解釋分子可以在水中形成纖維的原因。最近，有研究提出了3個超螺旋結構的模型，每個超螺旋結構由富含谷氨酰胺的轉角連接3個反平行螺旋區段組成(圖1d)[18]。

注：R代表重復單元[14]。圖1 α-Zein的四種三維結構模型

2 Zein的自組裝

2.1 Zein在乙醇水溶液中的自組裝與流變特性

Zein的4個組分中α-Zein可溶于70%～95%乙醇，β-Zein可溶于60%乙醇，卻不溶于95%乙醇，γ-Zein可通過還原劑溶解在乙醇中。商業Zein僅在水中溶解性差，可溶于含水乙醇，丙酮水溶液和pH≥11.5的堿性水溶液中[4 , 22]。

乙醇水溶液是Zein的常用溶劑，探究Zein在乙醇水溶液中的自組裝行為及流變特性，對Zein的工業應用與構建Zein的新型膠體結構有重要指導意義。Wang等[23]發現乙醇濃度影響著溶液粒子的粒徑和均一度，Zein溶液中粒子粒徑和PdI值隨著乙醇濃度的增加而降低。Kim等[24]也發現Zein在乙醇水溶液的聚集行為隨乙醇濃度變化而變化。如圖2所示，70%～93%乙醇濃度范圍內，隨著乙醇濃度增加(溶液極性減小)，Zein的粒徑先減小后增加，在乙醇濃度為90%時，粒徑最小。

觀察不同濃度乙醇水溶液中的Zein黏度變化能更好理解Zein的構象變化。Fu等[25]研究了Zein在乙醇水溶液中的流變行為，發現Zein表現出良好的牛頓流體行為，受Zein濃度、乙醇的質量分數和溫度影響：溫度對Zein的黏度的影響符合Arrhenius-type方程；Zein濃度增加，黏度以指數形式迅速增加；乙醇的質量分數增加，Zein的黏度減小。

圖2 玉米醇溶蛋白聚集體在乙醇水溶液中的尺寸變化[24]

2.2 Zein在反溶劑過程中的組裝機理與相分離過程

已知Zein含有大量非極性和中性氨基酸[9]，當Zein溶劑極性增加時，分子構象發生改變，溶解度降低，分子之間相互聚集，這個過程稱為Zein的自組裝。如Matsushima提出的α-Zein帶狀模型，Zein的兩端親水而表面疏水，賦予Zein兩親特性，這是Zein自組裝的主要驅動力?；贛atsushima的模型，Wang等[21]研究了乙醇揮發條件下Zein結構的變化行為，根據高分辨率透射電鏡(HRTEM)和圓二色譜(CD)的結果表明，隨著乙醇的揮發溶液的極性逐漸增強，Zein分子中的α-螺旋減少而β-折疊增多，即α-螺旋向β-折疊轉變；接著在疏水相互作用力的驅動下，β-折疊逐漸首尾相連，反向平行排列成條帶，最后條帶層層堆積、卷曲形成納米顆粒。

Zein、乙醇和水混合后的三元相圖如圖3a所示。在三相(Zein、乙醇與水)混合過程中，乙醇濃度減小，過飽和的Zein在溶液中發生聚集和成核。同時，由于乙醇的相對揮發度高，在攪拌的過程中，乙醇濃度進一步減小，加劇了Zein的成核過程。產生的核心通過捕獲游離狀態的Zein分子或奧氏熟化不斷生長，當Zein的初始濃度過高或出現大量核心時，核心主要通過已有粒子的無規則碰撞生長[26]。最后，粒子之間的聚集達到熱力學平衡狀態。而當溶液中Zein的濃度低于溶解度閾值時，粒子停止成長。Zein的溶解、成核和晶核生長等因素將會影響形成的粒子性質，載藥量與釋放性能。如乙醇、甲醇和異丙醇都可以用來構建Zein納米粒子，但得到的納米粒子大小不同，依次是乙醇 >異丙醇 >甲醇，這可能是Zein在溶劑中的溶解度不同和溶劑的揮發速率不同導致成核和晶核生長的速率不同[27]。除了溶劑類型，提高攪拌速率、增加溶劑濃度或減小Zein的濃度都可以得到尺寸較小的納米粒子[28]。粒子在形成過程中，溶劑與非溶劑不同的混合方法對Zein的濃度影響如圖3b、圖3c所示。此外，pH、溫度、添加劑等都會干擾Zein的溶解、成核與晶核生長過程，從而影響粒子的性質[5]。

圖3 Zein、乙醇和水混合后的三元相圖[14]

3 Zein的改性研究

由單一Zein制備的納米粒子存在包封率低、對環境敏感、胃腸控釋性能差等局限性[29]，難以在食品工業中大規模運用。本節介紹Zein的修飾和改性，改變Zein的結構和性質，改善其對生物活性物質的保護，以適應不同的應用需求。

3.1 物理改性

3.1.1 與多糖復合

Folter等[30]報道了用Zein膠體粒子制備O/W乳液，但乳液穩定性并不理想，這是因為Zein疏水性強，三相接觸角大于100°，難以有效穩定O/W界面。Zein的等電點在pH 6.2左右，當pH值高于6.2時Zein帶負電，反之帶正電。因此，Zein可以與不同電性的多糖發生靜電相互作用。另外，Zein與多糖之間還存在疏水和氫鍵相互作用力[31]?？梢酝ㄟ^改變多糖的類型(如果膠有線性陰離子主鏈和中性的支鏈結構，大豆多糖是糖鏈上綴合有蛋白的糖蛋白)和濃度、環境pH值、離子強度和溫度等因素調控蛋白多糖復合物的性質，從而達到對Zein改性的目的，提高Zein的穩定性和界面活性。例如，Zhou等[32]利用Zein與果膠的相互作用調控Zein的自組裝成核過程和界面排布行為，從而構建不同的界面結構來穩定高內相乳液。結果表明，較高的Zein與果膠復合比例和低pH值能產生有序的界面結構從而促進油滴堆積成3D網絡結構，得到的高內相乳液有較好的黏彈性和觸變性，提高了高內相乳液的抗氧化和儲藏穩定性。

3.1.2 與蛋白復合

Zein不溶于水，可自組裝成納米粒子，因此常用作良好的控釋載體。但Zein在等電點附近會發生聚集，鹽離子穩定性差，且干燥后的Zein納米粒子不易復溶，這些缺點使Zein的應用受限。Patel等[33]利用反溶劑沉淀法制備Zein/酪蛋白酸鈉復合粒子，把Zein溶液滴加到酪蛋白酸鈉溶液中，Zein聚集成納米粒子，帶相反電荷的酪蛋白酸鈉分子吸附在Zein的表面，形成了Zein/酪蛋白酸鈉核殼結構的納米粒子。結果表明，Zein/酪蛋白酸鈉納米粒子在NaCl濃度為0.015～1.5 mol/L范圍內仍保持穩定，顯著提高了Zein的鹽離子穩定性。另一項研究中，Pan等[34]采用pH循環法制備Zein/酪蛋白酸鈉雜化粒子。結果表明，不同于反溶劑沉淀法，pH循環法得到兩種蛋白互相雜化的納米粒子，該方法避免了乙醇的加入且得到的納米粒子在中性pH下仍保持穩定，也有效提高了Zein的復溶性。

3.1.3 與表面活性劑復合

有些表面活性劑與蛋白質可通過靜電或疏水相互作用緊密結合，改變Zein的表面電荷及親/疏水特性，提高復合納米粒子的穩定性。Deo等[35]利用十二烷基磺酸鈉(SDS)探究表面活性劑對疏水蛋白的改性行為。結果表明，在SDS存在下Zein的變性分為兩步：SDS濃度在4～200 mmol/L之間，SDS與Zein內部的氨基酸相結合，形成小的疏水微區；SDS濃度大于200 mmol/L時，Zein的結構完全展開，呈現棒狀結構。Dai等[36]將Zein和卵磷脂復合包埋姜黃素得到復合納米粒子，卵磷脂的加入改變了Zein的表面電荷和分子結構，大大提高姜黃素的包埋率及紫外光照和熱穩定性。

3.1.4 與多酚復合

單寧酸是一種富含羥基的多酚，能與許多生物大分子如蛋白、多糖和其他合成的聚合物發生相互作用。Zou等[37]證明單寧酸易與脯氨酸豐富的蛋白質發生疏水、氫鍵和靜電相互作用，并用單寧酸與Zein之間的氫鍵相互作用非共價修飾Zein納米粒子，并用改性后的Zein納米粒子制備乳液凝膠。結果表明，用單寧酸改性后的Zein納米粒子能顯著提高乳液的穩定性，單寧酸的加入影響反溶劑過程中Zein的自組裝行為，調控Zein納米粒子的表面潤濕性使Zein納米粒子的三相接觸角為86°左右。

3.2 化學改性

3.2.1 Zein的磷酸化改性

磷酸化改性是蛋白質化學改性常用的方法之一，常用的試劑有三氯氧磷、三聚磷酸鈉和焦磷酸鹽。磷酸化改性的機理為磷酸鹽特異性選擇蛋白側鏈的活性基團(如色氨酸或蘇氨酸的-OH及賴氨酸的ε-NH2)與其發生酯化反應，磷酸根基團的引入增加了蛋白質的電負性，從而改變蛋白質的功能性質[38]。在蛋白磷酸化過程中，磷酸的氫離子與氨基酸殘基提供的氫氧根離子通過消除反應形成酯鍵(-H2PO4)，然后與其他氨基酸殘基進一步發生消除反應，使蛋白質鏈交聯，形成單酯、雙酯或三酯化合物，反應過程如式(1)、式(2)所示[39]。Wu等[40]用磷酸化技術將磷酸基團引入Zein，提高了Zein在水中的溶解度；改性后的蛋白成膜性好，延伸率高，避免了塑化劑的加入，使Zein蛋白膜的應用范圍更廣更靈活。

Protein-NH2+ POCl3→ Protein-NH-POCl2+ HCl

(1)

Protein-NH-POCl2+ HOOC-Protein → Protein-NH-CO-Protein+HOPOCl2

(2)

3.2.2 Zein的糖基化改性

糖基化是蛋白質常用的改性手段，主要是將糖類化合物與蛋白質共價相連，得到兼具蛋白質和多糖功能特性的產物。糖基化改性包括美拉德途徑和轉谷氨酰胺酶途徑。但美拉德途徑的糖基化反應常伴隨一些副反應如形成有毒和致突變物質，產生褐變和不好的風味物質，而且糖化程度也不易控制。酶催化的糖基化途徑反應條件溫和也增加了安全性，具有研究和開發的前景。蛋白質分子中谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基的ε-氨基在轉谷氨酰胺酶的催化下發生反應，形成分子內或分子間ε-賴氨酸(γ-谷氨?；?異肽鍵，使蛋白質分子發生交聯。Wang等[41]用轉谷氨酰胺酶催化殼聚糖(Mw1 500)與Zein共價結合，糖基化后的Zein溶解性和表面疏水性顯著提高，抗氧化性能提高，有效抑制豬肉糜的脂質氧化。Yin等[42]用美拉德反應途徑，得到去酰胺的Zein多肽與多糖的共價產物，該產物在酸性條件下能很好地穩定乳液，適合食品飲料體系的應用。

3.2.3 Zein的去酰胺改性

蛋白質去酰胺是將蛋白質的中性氨基酸即谷氨酰胺(Gln)或天冬酰胺(Asn)水解成親水的谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)，同時蛋白質結構展開從而提高蛋白的功能性質[42]。去酰胺有酶法和化學法，化學法是通過酸/堿處理使蛋白質去酰胺，間接使蛋白質的肽鍵發生裂解，導致蛋白質水解，這個過程受反應時間影響。適度水解能增加蛋白質的柔韌性，暴露出一些活性基團，改善蛋白的功能特性；但過度水解會產生一些苦味肽，影響蛋白的應用[43]。Cabra等[43]采用堿法、酸法和酶法對Zein進行去酰胺處理，發現只有堿法去酰胺時沒有出現沉淀，且產物能很好地分散在中性水溶液中，Zein的乳化性和親水性大大提高。

3.2.4 Zein與多酚共價結合

多酚的化學結構復雜，含有許多反應活性基團，容易通過非酶/酶促反應被氧化[44]。在非酶促反應中，多酚被氧化成醌，進一步與蛋白質的游離氨基、賴氨酸、半胱氨酸和色氨酸發生親核加成反應[44]。多酚的酶促氧化通常用多酚氧化酶或漆酶來催化反應。在氧氣存在的條件下，處于鄰位的羥基可形成O-醌，進一步與蛋白質發生親核加成[45-46]。Liu等[47]用EGCG共價修飾Zein，然后用反溶劑法制備納米粒子共包埋姜黃素和白藜蘆醇。結果表明，改性的Zein納米粒子能有效保護姜黃素和白藜蘆醇并保留了它們的抗氧化活性。

3.3 酶法改性

利用酶將蛋白質水解成多肽，可以改善蛋白質的功能性質。酶具有特異性，可以選擇性裂解蛋白肽鏈的特定位點，改變酶或底物濃度，酶解時間和溫度可以控制蛋白質的水解程度，從而得到分子質量不同的多肽[48]。兩親性多肽自組裝是近年來的研究熱點，它可以自組裝成不同的納米結構，如膠束、納米管、納米纖維等[49]。這些納米結構因可作為功能性活性物質的運載體而頗具研究潛力。

眾所周知，蛋白或多糖可以穩定Zein膠體粒子，但復合Zein納米粒子粒徑較大(> 100 nm)，水溶液在外觀上渾濁不透明，限制了其在透明飲料中的應用。Zein經蛋白酶處理后，水溶性明顯增加，玉米肽的可解離基團數量增多，形成可溶性肽，酸性條件下不易凝聚，等電點處不易沉淀[50]。Wang等[51]用蛋白酶(Alcalase 2.4 L)水解Zein得到兩親性的蛋白肽，進一步與姜黃素復合形成納米復合物，得到的復合物粒徑小(<50 nm)且溶液透明。

3.4 冷等離子體改性

冷等離子體作為一種表面處理技術已被證明是一種改善聚合物粘附性和功能性而不損害整體性能的有前景的方法[52]。冷等離子體由于其非熱性質，在改性Zein基薄膜方面具有附加的效益，等離子體暴露在空氣中會形成過氧化氫和過氧化物，這些物質對在薄膜表面沉積極性基團具有積極的作用[53]。Dong等[54]研究了介質阻擋放電(DBD)大氣冷等離子體(ACP)技術對Zein粉末的理化性質和結構性質的影響：Zein的平均粒徑顯著降低，即ACP處理后聚集體解聚；Zein溶液中游離-SH濃度增加，pH值降低；蛋白分子構象重排。改性后的Zein膜相比于未處理的膜，抗拉強度和表面親水性都有所提高。Chen等[55]對Zein膜進行了兩步改性：復合殼聚糖后介質阻擋放電(DBD)冷等離子體改性，成功地改善了潤濕性、熱穩定性、機械和阻隔性能。

4 結論與展望

Zein特殊的氨基酸組成和分子結構決定了其性質和功能，影響著復合納米粒子的穩定性和運載效率。通過凝膠電泳獲得Zein的Z19和Z22兩種多肽可呈現阿螺旋輪、長帶狀、發夾和開放的超螺旋四種模型。本文從分子結構層面探討了Zein的自組裝、流變特性和相分離過程，即Zein在乙醇水溶液(不同的溶劑極性)的聚集行為隨乙醇濃度(溶液極性)變化而變化。但單一Zein構建的納米粒子會形成疏松的介孔結構，對環境敏感，存在諸多弊端，隨之出現多種Zein改性技術，包括物理改性、化學改性、酶法改性和冷等離子體改性，物理改性是Zein和其他分子之間存在靜電、氫鍵或疏水等非共價作用；化學改性使蛋白質分子結構改變，可能發生交聯、氨基酸水解等化學反應，蛋白-多酚可產生不可逆的共價鍵或發生親核加成反應；酶法改性即通過特定的酶將蛋白質水解為不同分子質量的多肽；冷等離子體改性技術就是不借助其他物質，在不損害原有優質性能的前提下改善其部分不良性質。然而，對于改性后的Zein在體內是否存在毒性或是否污染環境必須在其應用于食品等領域之前確定，但這方面的潛在風險尚不清楚。在人體內作用于不同靶器官的控釋問題也是將來熱門研究的話題之一。