MAPKs通路磷酸化激活在擴張型心肌病患者心肌纖維化中的臨床意義

周易，劉暢，易欣，蔣學俊

擴張型心肌?。―CM）是指在心臟無異常壓力負荷或冠狀動脈（冠脈）疾病等其他心臟疾病的情況下，出現的以左心室或雙心室擴大并伴有心臟舒張、收縮功能障礙的一類疾病，是臨床上出現進展性心力衰竭和心源性猝死的主要原因[1，2]。心室重構是DCM的主要病理改變，包括心肌細胞不規則肥大和心肌纖維化[3]。研究發現絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路參與調控真核細胞內許多重要生理活動，涉及細胞增殖、分化和凋亡等[4]。研究發現，MAPKs信號通路與壓力負荷過大或心肌缺血所致的心肌纖維化密切相關。因此，本研究擬通過檢測DCM臨床心肌組織樣本中MAPKs信號通路分子的總蛋白及磷酸化水平，以及其下游分子早期生長反應因子（EGR-1）的表達水平，探討MAPKs信號通路激活在DCM患者心肌纖維化中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集DCM患者接受心臟移植者受體心臟6例（DCM組），并選擇移植失敗的供體心臟6例作為對照組。DCM的診斷標準參照2006年美國AHA制定的DCM診斷標準，即左心室舒張末期內徑＞55 mm、左心室射血分數（LVEF）＜45%或左心室縮短速率＜25%[5]。排除冠狀動脈性心臟病、先天性心臟病、高血壓、自身免疫性疾病等可以引起心臟擴張的心血管疾病和全身性疾病。同時，收集DCM患者一般臨床資料，包括年齡、性別、左心房內徑（LAD）、右心房內徑（RAD）、左心室內徑（LVD）、右心室內徑（RVD）、室間隔厚度（IVSD）、LVEF。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集收集DCM患者受體心臟及移植失敗的供體心臟的左心室肌組織。切取離體心臟的左心室肌組織，生理鹽水沖洗后，分為兩份。一份立即放入凍存管于液氮中迅速冷凍后-80℃冰箱中保存，用于Western Blot檢測；另一份置于4%多聚甲醛中固定，制作病理石蠟切片，后續染色觀察。

1.2.2 Western Blot法檢測心室肌組織中MAPKs信號通路分子的磷酸化水平Western blot法測定兩組心室肌組織中MAPKs信號通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的總水平和磷酸化水平、以及下游分子EGR-1的蛋白表達水平。心室肌組織研磨后加入新鮮配制的蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定各樣品的蛋白濃度，將各樣品蛋白濃度調整一致，與上樣緩沖液混合，加熱煮沸10 min，使蛋白充分變性，并分裝保存在-80℃。蛋白溶解后，行SDS-PAGE凝膠電泳，再4℃下轉膜，PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別加入抗MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38、EGR-1、GAPDH一抗，4℃孵育過夜。次日，二抗孵育2 h，顯影。以GAPDH為內參，測定目標條帶及GAPDH的灰度值，兩者灰度值比值為目的蛋白的相對表達水平。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色（HE染色）4%多聚甲醛固定后的心室肌組織，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。石蠟切片依次經二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫苯、水洗、蘇木素染色、0.1%鹽酸酒精分化、Scott液返藍、伊紅染色、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；最后，顯微鏡下觀察心肌組織的形態結構及排列特點。

1.2.4 苦味酸-天狼星紅染色（PSR染色）制備好的石蠟切片常規脫蠟、脫水后，依次經磷鉬酸染色、0.1%苦味酸天狼星紅染色、0.01N鹽酸分化、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；最后，光學顯微鏡下觀察心肌組織中紅色膠原纖維的分布情況，拍照并計算膠原容積百分比（CVF），CVF=膠原面積/圖像面積×100%。

1.3 統計學處理計量資料數據采用均數±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件，進行數據統計分析。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料DCM患者和對照組年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。DCM患者超聲心動圖檢查提示心室擴大，左心室擴張更為顯著（69.83±14.71 mm），呈離心性擴張；心肌室壁運動幅度普遍減低，左室射血分數明顯下降（26.83±8.49%）。

2.2 DCM患者心肌組織學病理改變與對照組相比，HE染色見DCM組心肌組織內心肌細胞不同程度肥大，胞漿內少許空泡形成；心肌細胞排列紊亂，周圍間質組織纖維化明顯（圖1A）。PSR染色可見DCM組心肌組織間質內大量增粗的、亮紅色膠原纖維沉積，呈彌漫性分布，CVF較對照組顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1B和1C）。以上提示，DCM患者心肌纖維化、心室重構明顯。

2.3 DCM患者心肌組織MAPKs信號通路分子的總蛋白及磷酸化水平Western Blot結果顯示，兩組間MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的總蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，DCM組心肌組織內MEK1 /2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的磷酸化水平均明顯增高（P＜0.05），差異具有統計學意義（圖2）。

2.4 MAPKs信號通路下游分子EGR-1的蛋白表達水平Western Blot結果顯示，與對照組相比，DCM組心肌組織內MAPKs信號通路下游分子EGR-1的蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），差異具有統計學意義（圖3）。

3 討論

目前，DCM臨床治療大多基于血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體阻滯劑等藥物，通過減慢心率、減緩心室重構等改善DCM患者的預后，心臟移植是終末期DCM患者最佳的治療手段[6]。研究表明，心肌纖維化是DCM的主要特征，細胞外基質內大量膠原蛋白沉積；這些膠原蛋白主要由心臟成纖維細胞（CFs）合成，正常心肌中I型膠原蛋白（Col Ⅰ）與Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）的比例相對恒定，心肌纖維化時心肌組織中ColⅠ與Col Ⅲ的比例升高[7，8]。因此，減輕甚至逆轉心肌纖維化，是目前DCM治療研究的新方向[9]。本研究發現，DCM患者心肌組織中ColⅠ、Col Ⅲ的表達增加，CVF明顯升高，與既往研究類似。

圖1 對照組和DCM組心室肌組織的病理學改變[A和B為對照組和DCM組患者心室肌組織HE染色及PSR染色結果（HE染色×40，PSR染色×20；PSR染色中黃色為心肌組織，紅色為膠原纖維），C為對照組和DCM組患者心室肌組織的CVF。與對照組相比，P＜0.05]

圖2 對照組和DCM組患者心肌組織中MEK1 /2、ERK1 /2、JNK1/2、P38的總蛋白及磷酸化水平（與對照組相比，**P＜0.01，***P＜0.001）

圖3 對照組和DCM組患者心肌組織中EGR-1的蛋白表達水平（與對照組比較，**P＜0.01）

MAPKs信號通路是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的信號轉導系統的重要成員，通過MAPKK激酶（MAPKKK/MEKK）、MAPK激酶（MAPKK/MEK）和MAPK的級聯模式傳導細胞外信號，依次磷酸化激活將上游信號傳遞至下游應答分子，參與調控細胞增殖、分化、遷移、凋亡、炎癥和纖維化修復等生物學過程[10，11]。在哺乳動物中，研究較為廣泛的MAPKs信號通路是細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）/應激活化蛋白激酶（SAPK）和P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase）信號通路[12-14]。Chang等[15]利用促炎因子IL-17對兔缺血性心力衰竭模型進行處理，心肌組織內p-P38 、p-JNK、p-ERK1/2及其下游靶蛋白IL-6、TNF、CCL20、CXCL1的表達水平升高，促進心肌細胞炎癥、凋亡、纖維化進程，最終導致心室重構。此外，RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2通路的激活可促進CFs的增殖、促進心肌組織間質內膠原沉積，加速心肌纖維化的進展；而ERK1/2抑制劑可顯著抑制CFs增殖、膠原蛋白合成及纖維化相關基因的表達，最終減輕心肌纖維化[16-18]。部分臨床前研究發現P38通路在缺血性心臟病、心肌梗死和動脈粥樣硬化中發揮重要作用[19]。本研究發現，DCM患者心肌組織中MAPKs信號通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的磷酸化水平也增高，尤以MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平升高最為顯著，以上結果表明MAPKs信號通路的磷酸化激活可能對DCM心肌纖維化、心室重構發揮促進作用。

早期生長反應因子（EGR-1），最早被認為是一種腫瘤抑制因子，在細胞生長、分化和存活中發揮作用，后發現其在免疫應答的啟動過程中也發揮重要作用，是生長因子介導纖維化的核心轉錄因子[20]。EGR-1可作為ERK1/2通路的下游調控分子，γ-谷維素可清除活性氧參與抑制ERK1/2通路，從而抑制EGR-1的表達[21]。EGR-1可與啟動子結合上調骨橋蛋白（OPN），OPN又可通過ERK1/2信號通路上調EGR-1的表達，在血管平滑肌細胞遷移和增殖中發揮重要作用；ERK1/2通路抑制劑PD98059、JNK通路抑制劑SP600125、P38通路抑制劑SB203580分別處理血管平滑肌細胞，均可顯著抑制OPN誘導的EGR-1表達，而ERK1/2抑制劑PD98059的抑制作用最顯著[22]。Yasuoka等[23]研究結果表明，胰島素樣生長因子結合蛋白-5（IGFBP-5）通過激活MAPK信號、誘導核EGR-1與IGFBP-5相互作用，促進纖維化基因轉錄，從而誘導肺纖維化表型。本研究發現，DCM患者心肌組織中MAPKs下游效應分子EGR-1的表達也明顯升高，進一步表明MAPKs信號通路的磷酸化激活，促進下游應答分子EGR-1的表達，再對DCM心肌纖維化、心室重構發揮促進作用。

綜上所述，MAPKs信號通路在促進DCM患者心肌纖維化中發揮重要作用，不是通過單一信號途徑實現，而是多條信號通路協同促進DCM患者心肌纖維化的進展。動物實驗中應用MAPKs信號通路各級激酶的抑制劑有助于抑制心肌纖維化，仍處于臨床前研究階段；目前，臨床上尚缺乏治療DCM的MAPKs信號通路抑制劑類藥物。值得堅信的是，DCM的臨床治療，尤其在減輕心肌纖維化、改善心室重構方面，MAPKs通路仍是值得深入研究的重要靶點。