基于GC-MS的6種常見霉菌純培養期間揮發性物質的檢測

胡振陽 都立輝 楊衛民 劉凌平 袁 康 袁 建 鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室1，南京 210023) (國家糧食和物資儲備局標準質量中心2，北京 100037)

我國每年都會儲藏和輪換大量糧食[1]，由于糧食生產的地區不均衡性，我國“北糧南運”，糧食工程可達2億噸左右[2]。糧食生產中不可避免的攜帶的蟲卵和霉菌孢子，隨著糧食的收獲進入儲藏環節，造成了糧食安全隱患。據聯合國糧農組織(FAO)估算，全世界因糧食等農作物產品受霉菌污染所造成的經濟損失可達數千億美元，而我國每年因霉菌污染造成的糧食損失高達2 100萬t，占全國糧食總產量的4.2%，同時產毒霉菌產生的毒素對全世界25%的糧油作物造成污染[3]，甚至嚴重威脅人畜健康[4,5]。霉菌由于消耗其營養成分, 快速繁殖造成糧食營養價值、加工工藝品質等受到嚴重影響[6]。因此，糧食中霉菌污染的早期檢測是預防和控制糧食中霉菌污染的關鍵。由于霉菌不斷分解霉變糧食有機質會產生一些特征揮發性物質，隨著糧食種類、污染霉菌的種類、污染程度的改變，這些代謝產物會發生變化，而這些揮發性物質可作為糧食霉變的指標[7,8]。

早期關于對不同含水量的小麥霉變檢測也證實霉變糧食的揮發性組分的特征性[9]。目前，多數研究側重于稻谷霉菌數量的定性區分[10,11]，缺乏對稻谷中霉菌自身特征性揮發性成分的研究。本研究利用氣相色譜質譜聯用(GC-MS)技術對六種稻谷中常見霉菌的揮發性氣體物質進行檢測分析，以期找出不同種類霉菌生長階段的特異性揮發性物質，來精確篩選霉菌種類，獲取早期預防糧食霉變的準確信息，為糧食中進一步霉菌的快速檢測及早期預警提供參考。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、標準菌株灰綠曲霉3.3975以及由南京財經大學從稻谷中分出并經基因鑒定的亮白曲霉菌株、橘灰青霉Pp、產黃青霉M31、尖孢鐮刀菌Pr、有毒鐮刀菌6株。

1.2 主要儀器

GC(7890A)-MS(5975C)氣質聯用分析儀；50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭；65 μm-PDMS/DVB固相微萃取頭；手動SPME進樣手柄； YX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；WH-2微型旋渦混合儀；BCD-268WSV型冰箱；血球計數板；EX30生物顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 霉菌孢子懸浮液的收集與處理

將6種稻谷霉菌接種到經120 ℃滅菌20 min的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)中于28 ℃培養箱中培養7 d，取5 mL的滅菌水于培養基表面。輕微振蕩后，移取培養基表面的孢子懸浮液于EP管中。將孢子懸浮液置于WH-2微型旋渦混合儀振蕩混勻20 s，取50 μL混勻的孢子懸浮液于清洗干凈的血球計數板上，在顯微鏡下觀察并計數。將6種霉菌孢子懸浮液的孢子濃度用無菌水調至106個/mL數量級的濃度，置于-20 ℃冰箱中保藏備用。

2.2 霉菌的培養

以灰綠曲霉3.3975為例，分別取10 mL經120 ℃滅菌20 min的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)分別置于2個100 mL的錐形瓶中，搖勻，共計得到2瓶的PDA培養基。待培養基凝固后，取50 μL稻谷霉菌孢子懸浮液加入到裝有培養基的1個錐形瓶中，搖勻，剩余1瓶PDA培養基加入50 μL的無菌水做空白對照，用錫紙及無菌膜封住錐形瓶瓶口，28 ℃條件下培養，共培養15 d，每隔1 d進行GC-MS檢測分析，其中每個樣品均檢測3次。其余5種稻谷霉菌培養條件同上。

2.3 GC-MS檢測

分別選取培養1、3、5、7、9、11、13 d和15 d的霉菌樣品及空白樣品進行GC-MS檢測分析，把裝有樣品的錐形瓶置于30 ℃恒溫水浴鍋中平衡1 h，分別使用50/30 μm-PDMS/DVB/CAR和65 μm-PDMS/DVB兩種固相微萃取頭定期檢測樣品，所有實驗均測定3次，將固相微萃取頭穿過無菌膜、錫紙的小孔插入到錐形瓶中，頂空萃取40 min后，將萃取頭迅速插入到GC-MS進樣口中，250 ℃不分流模式下解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度為250 ℃，總流量為34 mL/min，隔墊吹掃流量為3 mL/min,載氣為氦氣，設定流速為1.0 mL/min，采用不分流的分流方式，GC-MS升溫程序見表1。

質譜條件：接口溫度為280 ℃，離子源為EI，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍(m/z)50～400 amu，采集模式為全掃描。

表1 GC-MS升溫程序

2.4 實驗數據處理

實驗數據經計算機檢索，并與NIST 08標準質譜庫匹配求得，統計匹配度大于80的揮發性成分。采用峰面積歸一化法，以各揮發性物質的峰面積占總峰面積的比值表示該物質的相對含量。采用Excel軟件進行數據統計及繪圖。

3 結果與討論

通過對每個樣品GC-MS譜圖檢索結果中的揮發性成分進行分類，可分成烷類、烯類、醇類、酮類、醛類、酸酯類、雜環類及其他共七大類，與曹俊等[12]的研究結果基本一致，并對揮發性物質類別的含量進行統計分析，各個成分的含量變化趨勢以柱狀圖展示。

3.1 空白樣品揮發性物質分析

由圖1可知，醛類物質含量最高，其次是烷類物質，醛類物質基本先增加后減少，第7 d含量最多，其他類物質變化趨勢不明顯。這方面兩種固相微萃取頭萃取所得結果相同，而酸酯類、醇類和酮類物質含量在使用50/30 μm固相微萃取頭檢測時的結果比較低，這與65 μm固相微萃取頭萃取所得結果有些差異，說明同樣培養基采用不同固相微萃取頭萃取所得的揮發性物質也會不同，這應主要與固相微萃取頭表面的纖維涂層有關，不同的纖維涂層可以吸附不同的物質。

采用不同的固相微萃取頭可精準篩選出同一真菌代謝途徑中生物合成的衍生化合物，例如，在同一培養介質中始終能被檢測到的揮發性成分可作為實時監測并鑒別霉菌污染的指示物。對典型揮發性指示物選取合適的傳感裝置，進行構建糧食中霉菌污染實時監測的系統,并通過結合模式識別法可同時鑒別出霉菌種類，為后期實時監測提供良好的參考價值。

圖1 空白樣品揮發性物質分析

3.2 灰綠曲霉3.3975的揮發性物質分析

由圖2a可知，第1 d，醛類物質含量最高。這與對應的空白樣品相同。第3/5 d，烯類物質迅速增加，醛類物質含量降至0，雜環類物質有所增加。烷類物質在整個過程中先增加后減少，第9 d含量最高；烯類物質在霉菌生長過程中，先減少后增加。與對應的空白樣品相比較得出特殊性揮發性成分：1,3-二氯苯，1,4-二氯苯，雙環辛-1,3,5-三烯，吡嗪，1,3-二嗪。

圖2 灰綠曲霉3.3975的揮發性物質分析

由圖2b可以看出，第1 d，醛類物質最多，這同樣與相對應的空白樣品的結果相似。第3 d，醛類物質含量有所下降，雜環類物質增加，與對應的空白樣品相似，不同的是空白樣品醇類物質增加，而培養灰綠曲霉3.3975樣品的醇類物質幾乎不變，這與霉菌的生長有關。第5 d，烷類物質和醇類物質迅速增加，而醛類物質減少至0。此后揮發性物質主要是烷類物質，至15 d烯類物質迅速增加。2種固相微萃取頭對灰綠曲霉3.3975的揮發物質分析，同樣存在不可避免的差異性，但1,3-二氯苯、1,4-二氯苯兩種產物幾乎在每次的測定中均被顯著地穩定檢測出，2種固相微萃取頭檢測互相佐證將其判定為特殊性揮發性成分。

3.3 亮白曲霉的揮發性物質分析

由圖3a可知，第1 d醛類物質含量最高，第3 d酮類含量為0，而烷類和烯類物質含量較高，第5 d烯類物質含量最高，此后烯類物質減少，而醇類物質逐漸增加。其特殊性揮發性物質是十一烷、乙基苯、苯乙烯、檸檬烯、桉油精、1,3-二嗪。

由圖3b可知，第1 d醛類物質相對含量最高，第3 d酮類物質迅速增加，這一結果在2種萃取頭上獲得的結果差異較大，第5 d雜環類物質和烷類物質迅速增加，與用50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭檢測不同的是，第5 d后雜環類相對含量減少，而烷類和醇類物質含量較高。其特殊性揮發性成分以其烷類和醇類物質為主，分別是十一烷、十二烷、二叔丁基對甲酚、桉油精，其中桉油精是一種醇類物質。

圖3 亮白曲霉的揮發性物質分析

3.4 橘灰青霉Pp的揮發性物質分析

由圖4a可知，第3 d烷類物質含量較高。得出的特殊揮發性物質：檸檬烯、羅漢柏烯、1-乙基環戊烯、倍半水芹烯、2-甲氧基-3-(1-甲基乙基)吡嗪、2-甲氧基-3-(1-甲基丙基)吡嗪、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)吡嗪、十二烷、二十八烷、亞乙基環戊烷。

由圖4b可知，第1 d醛類物質含量最高，此后主要為烯類和雜環類物質，其特殊性揮發性成分為1-乙基環戊烯、α-柏木烯、羅漢柏烯、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)-吡嗪、2-甲基異莰醇、1,3-二甲氧基苯。1,3-二甲氧基苯可作為一種曲霉屬中雜色曲霉群特異性揮發性物質的指標。較早的研究發現，其僅在雜色曲霉菌培養過程中檢測到[13,14]。在本研究中，該化合物在橘灰青霉生長代謝階段中同樣被檢測到，與Matysik等[15]在鏈格孢菌、擬青霉和各種青霉菌的頂空固相微萃取中檢測分析結果一致。

圖4 橘灰青霉Pp的揮發性物質分析

3.5 產黃青霉M31的揮發性物質分析

由圖5a可知，特殊揮發性成分有：鄰二甲苯、對二甲苯、乙苯、1,4-二氯苯、1,3-辛二烯、苯乙烯、雙環[4.2.0]辛-1,3,5-三烯、3-環庚烯-1-酮、1,3-二嗪，既有與65 μm固相微萃取頭萃取得到相同的物質，也有不同的物質?，F今被檢測到的揮發性物質，例如1-辛烯-3-醇、2-苯乙醇和1,3-二甲氧基苯，大多不同的真菌屬都可揮發產生[16]。

觀察圖5b可知，第1 d主要為醛類物質，第3 d醛類物質迅速下降，而烯類和烷類物質顯著增加，此后揮發性物質主要為烷類和烯類物質。在第11 d烯類物質含量很高，而此時烷類物質含量很低。得出的特殊性揮發性物質是：鄰二甲苯、對二甲苯、1,3-二甲苯、1,3-二氯苯、1,3-辛二烯、5-(1-甲基亞乙基)-1,3-環戊二烯。

圖5 產黃青霉M31的揮發性物質分析

3.6 尖孢鐮刀菌Pr的揮發性物質分析

觀察圖6a可知，對比65 μm固相微萃取頭的結果，物質含量變化相似，得出的特殊揮發性物質是檸檬烯、貝殼杉烯、十一烷、十二烷、1,3-二嗪。

由圖6b可知，第1 d醛類和烷類物質含量較高，第3 d烯類和酸酯類物質顯著增加，此后揮發性物質主要是烯類物質。得出的特殊揮發性成分有檸檬烯、貝殼杉烯、1,8-二甲基-4-(1-甲基乙烯基)螺[4.5]癸-7-烯、三十一烷、十四烷、1,3,5-三氯-2-甲氧基苯。

圖6 尖孢鐮刀菌Pr的揮發性物質分析

3.7 有毒鐮刀菌的揮發性物質分析

觀察圖7a可知，第1 d醛類物質含量最高；第3 d主要是醛類和醇類物；第5天烷類、烯類、酸酯類物質增多；第7 d雜環類物質含量最高；第9 d主要是烷類、烯類和雜環類物質；此后主要是酮類和醛類物質。得到的主要揮發性物質有1,3-二甲苯、乙苯、1-氯-2-甲氧基苯、1,3-二氯-2-甲氧基苯、2,4-二氯-5-氟苯乙酮、3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、芐腈、萘。

1,3-二甲苯在Roussel等[17]的研究中發現為曲霉屬的特異揮發性組分。這是首次在有毒鐮刀菌生長代謝過程中檢測出1,3-二甲苯的存在，但50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭發現其作為主要揮發性成分，由于分析監測的手段日益增多，多種揮發性組分也日益顯現，為后期實時監測途徑提供不同真菌屬代謝組分，為快速定性定量檢測奠定堅實基礎。

由圖7b可知，第1 d醛類物質含量最高，第3 d酸酯類物質顯著增加，5～9 d主要為烯類、酸酯類和雜環類及其他物質，11 d后主要為酮類和醛類物質，其特殊的揮發性物質是三環庚烷、3-蒈烯、α-石竹烯、順式-α-紅沒藥烯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、2,4-二氯-5-氟代苯乙酮、甲氧基乙酸，2-十四烷基酯。

圖7 有毒鐮刀菌的揮發性物質分析

3.8 討論

GC-MS檢測結果表明，灰綠曲霉的醛類物質由高到低，烯類物質先減少后增加，烷類物質先增加后減少；亮白曲霉醛類物質由高到低，烯類物質先增加后減少，醇類物質含量逐漸增加；橘灰青霉前期醛類物質含量最高，中后期主要為烯類和雜環類物質；產黃青霉前期醛類物質含量最高，中后期主要為烷類和烯類物質；尖孢鐮刀菌前期醛類和烷類物質，中期烯類和酸酯類物質，后期主要是烯類物質；有毒鐮刀菌前期醛類物質，中期酸酯類物質顯著增加，后期主要為烯類、酸酯類和雜環類及其他物質。同種菌屬間不同生長代謝階段揮發性物質種類與含量差異顯著，而不同菌屬間的特征揮發性物質差異更加顯著，表明微生物在生長過程中，其產生的揮發性物質種類逐漸增加，相應增加其特異性。

對于微生物產生復雜的揮發性組分而言，受關注度也漸漸顯露，但紛繁復雜的功能作用仍難以闡釋。本研究初步確定6種稻谷常見霉菌的特征揮發性物質，但這些物質在霉菌生長階段的釋放機理尚不清楚, 可在今后的研究中進行深入探討。揮發性組分在調節作物生長、發育、防御以及作物間信號通路聯絡具有豐富的優勢[18]。但報道稱，現已關注的10 000種微生物中，僅有400種能夠產生揮發性化合物[19]。本研究中的6種稻谷優勢真菌在不同的頂空固相微萃取頭被檢測出的揮發性成分顯現出良好的特異性，將其對比研究參考，更有可能鑒定出對應菌屬的生長狀態，快速響應糧食品質的防控方案。此外，其揮發性組分被農業科學家視為控制各種植物病原體的生物防治劑及作物生長的生物肥料，在食品工業中，其生物防治特性被用于采后作物疾病預防。而關于被作為生物燃料的潛在來源的研究，微生物揮發性組分的優勢更加突顯[20]。

4 結論

利用GC-MS技術，采用兩種不同的萃取頭對6種糧食儲藏過程中的特征霉菌在純培養基上生長期間產生的揮發性成分進行研究。結果表明，6種常見稻谷霉菌生長期間產生的揮發性物質主要是烷類、烯類、醇類、酮類、醛類、酸酯類、雜環類及其他等七大類。篩選出6種霉菌的特異性揮發性組分，其中，灰綠曲霉：1,3-二氯苯、1,4-二氯苯；亮白曲霉：十一烷、桉油精；橘灰青霉Pp：1-乙基環戊烯、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)-吡嗪；產黃青霉M31：鄰二甲苯、對二甲苯、1,3-辛二烯；尖孢鐮刀菌Pr：檸檬烯、貝殼杉烯；有毒鐮刀菌：3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛。與僅通過二氧化碳的氣體濃度檢測霉菌的生長相比，相應霉菌特征成分的檢測更有可能鑒定到對應霉菌種類的生長，可通過構建糧食中霉菌污染實時監測的系統鑒別出霉菌種類，尤其是霉菌的早期實時在線監測，為糧食儲藏的精準安全控制提供參考。