血清總膽固醇水平對機采血小板保存期間活化損傷的影響

蔣 靚，張光波，謝金晶，李維潔，湯龍海

（1.蘇州市中心血站，江蘇 蘇州 215006；2. 蘇州大學附屬第一醫院江蘇省臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215007）

血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，直徑只有2～3 μm，是血液中最小的血細胞，其主要是骨髓成熟的巨核細胞質裂解形成的不規則碎片。血小板在體內發揮著重要作用，如止血凝血、炎癥反應以及免疫應答等[1]。因此血小板輸注在臨床治療中具有重要地位，機采血小板能夠穩定血小板質量，提高采集效率以及增加安全性，但在(22±2)℃震蕩保存的機采血小板保存期為5 d，隨著保存時間以及暴露時間的增加，機采血小板的聚集水平以及活性損傷發生變化。相關研究表明，血清總膽固醇（TC）水平升高易導致動脈粥樣硬化及相關疾病的發生[2]。本次研究旨在探討體外膽固醇負載對機采血小板在保存期間的活化損傷影響，現將相關情況總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 擬納入2019年4月—2019年6月蘇州市中心血站無償捐獻機采血小板供者35 名，男性，年齡為25～40 歲。符合國家規定的獻血者體檢標準，同時滿足以下要求：采前外周靜脈血血小板達到(150～449)×109/L；2 次的采集間隔時間≥14 d；采集前72 h內未服用阿司匹林類藥物。使用自動生化分析儀進行臨床常規TC測定，根據血小板捐獻者的血清TC水平分為兩組：血清總膽固醇水平升高組（TC≥5.2 mmoL/L，n＝31）和血清總膽固醇水平正常組（TC＜5.2 mmoL/L，n＝4）。

1.2 方法 采用濾白法機采血小板，采用MCS+血細胞分離機和994E耗材（美國血液技術公司），選擇LDPLP程序進行血小板采集。血小板采集設定量為≥2.5×1011/袋；血小板容量設定為250～300 mL；同時進行血小板質控檢測，質量符合機采血小板國家質量標準。利用機采血小板的留樣袋，每人份留取血小板10 mL，置于(22±2)℃水平震蕩的血小板保存箱內保存，分別于第2、3、4、5天時，取出部分血小板使用小留樣袋或EP管分裝4 袋，室溫下靜置，分別于0、30、60、120 min留取血小板樣本，進行流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測：用磷酸鹽緩沖液調整血小板濃度為(1～3)×109/L的血小板懸液。同型對照組加入磷酸鹽緩沖液各20 μL；測定管加CD63-FITC、CD36-PE、CD40-FITC、CD62p-PE各20 μL；取上述血小板懸液20 μL分別加入同型對照管和測定管，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min；加入1 mL 4%多聚甲醛混勻，上機檢測。

1.3 觀察指標 分別于保存第2、3、4、5天進行兩組血小板計數，并于0、30、60、120 min使用流式細胞儀檢測血小板的CD63、CD36、CD40以及CD62p表達水平。觀察比較兩組不同血清TC水平下的血小板活化水平，其中包括CD63：血小板顆粒膜蛋白，為血小板的活化指標；CD36：血小板膜糖蛋白是磷脂酰絲氨酸的主要受體，廣泛存在于血小板、脂肪粒細胞中，與血小板活化指標密切相關；CD40：與血小板活化呈正相關，是炎癥相關因子，可以作為血小板活化的表面標志物；CD62p（P選擇素）：血小板溶酶體膜糖蛋白，是血小板活化的表面標志物，能夠準確反映血小板的活化程度[3]。

1.4 統計學方法 所有數據使用Excel軟件和SPSS 11.0進行處理與統計，血小板的檢測數據使用中位數表示；兩組數據之間的比較采用非參數檢驗中的Wilcoxon檢驗，兩組以上數據之間比較采用Friedman檢驗，若P＜0.05，表明差異具有統計學意義。

2 結果

血清總膽固醇升高組血小板在不同保存時間下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表達率同血清總膽固醇正常組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 兩組血小板活性的比較

血清總膽固醇升高組血小板在不同暴露時間下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表達率與血清總膽固醇正常組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。（表2～表5）

表2 兩組血小板第2天活性的比較

表3 兩組血小板第3天活性的比較

表4 兩組血小板第4天活性的比較

表5 兩組血小板第5天活性的比較

3 討論

受到現有技術制約以及血小板具有特殊的分子結構，新鮮血液中分離出的血小板在22 ℃、60 次/min振蕩條件下的存放時間僅為5 d，這種較短的保存時間極大地限制了臨床上急需輸血患者的急救。由于血小板在保存過程中因活化而黏附能力上升，國內外輸血界一直關注血小板制備與保存的相關問題，亟待尋找導致血小板活化的相關負性調控因子[4]?；罨“宓谋砻鏄酥疚锟梢酝ㄟ^流式細胞儀檢測到，不同于CD63在血小板的質膜中表達，CD62P是血小板活化過程中釋放最多的顆粒膜上糖蛋白，在血小板的活化過程中其上升最為明顯，較為容易檢測到，一般作為血小板保存過程中最主要的質控指標之一。另外，CD36以及CD40/CD40L在血小板正常情況下基本不表達，只有血小板功能受損，質膜發生結構變化暴露出其糖表位才能夠檢測到其表達升高[5]。本次研究中設置不同暴露時間下，血小板活化能力的變化表明，在5 d保存期間內，血小板的活化水平沒有顯著上升，表明機采血小板在22 ℃、60 次/min振蕩條件下能夠一定程度上保留血小板的活性以及功能，維持其黏附結合能力，減少血源性疾病的傳播，對于臨床病人急救輸注具有不可代替的作用。動脈粥樣硬化以及與其相關的血栓等疾病的發生，例如中風、心肌梗死等疾病密切相關的是體內膽固醇水平升高[6-7]。研究發現，患有高脂血癥的病人體內血小板的活化損傷水平、血小板炎癥反應以及聚集水平明顯增強，并且相關體外實驗也表明，膽固醇水平過高容易導致血小板活化能力增強[8-10]。本次研究旨在表明，體外膽固醇負載對機采血小板在保存期間的活化損傷無顯著影響。

本次研究表明，機采血小板的活性損傷與高TC水平無顯著相關性，高TC水平的獻血者提供的血小板在保存期間以及相關暴露時間下無明顯活化聚集影響，可用于患者的臨床輸注。綜上所述，在血小板保存期內，血小板在不同暴露時間下其活性變化無明顯差異，不同TC水平的獻血中，TC水平對血小板的活化水平無顯著影響，在使用機采血小板進行輸注時可以選擇高水平TC的獻血者提供的血小板，進而提高血小板采集范圍和來源。