CDKN2A和CDKN2B區域間的基因多態性與漢族人群顱內動脈瘤性別差異性的關聯分析

歐陽嶷，閻雪晶，劉 穎，張 婧

（中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 沈陽 110001）

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是一種危及生命的腦血管病急重癥，約有80%的SAH是由顱內動脈瘤（intracranial aneurysm,IA）破裂造成的，女性罹患SAH和IA的比率約為男性的1.6倍[1-2]。近來，全基因組關聯研究（GWAS）證實染色體9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區域與歐洲、日本人群的多種血管疾病相關[3-5]，但迄今為止CDKN2A-CDKN2B區域基因多態性與漢族人群IA是否存在關聯僅有少數報道[6]，尚無定論。

本研究以中國漢族IA病例作為研究對象，通過病例對照的關聯分析方法，研究CDKN2ACDKN2B區域的基因多態性與漢族人群IA的相關性。在此基礎上，采用分層分析的方法，從遺傳學角度探討存在于IA患者的性別差異與上述基因多態性是否存在關聯。

1 資料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 入選標準：IA組：選取近十年由中國醫科大學附屬第一醫院神經內科和神經外科門診、急診及病房確診的IA患者500 例，入選病例均為漢族。所有患者均經數字血管減影造影（DSA）和/或頭部三維CT血管造影（3D-CTA）和/或頭部核磁血管造影（MRA）或手術證實存在IA（指囊性動脈瘤）。

對照組：同時期500 名健康志愿者，均為漢族，無血緣關系，年齡和性別與IA組相匹配，無心腦血管疾病、血液系統疾病、肝腎疾病、腫瘤、感染以及自身免疫性疾病等。所有對照組成員經神經影像學（MRA或3D-CTA）證實無IA。

研究經過中國醫科大學倫理委員會通過，所有受試者均簽署知情同意書。年齡未滿18 歲或存在重度功能殘疾者（如意識障礙、嚴重肢體功能障礙等）均需征得法定監護人同意并簽字。

1.1.2 排除標準：有下列情況之一者，予以排除：各種血液系統疾病或有出血傾向者（血小板計數＜100 ×109/L）；有嚴重的肝腎疾病、腫瘤、感染、自身免疫性疾病等；存在多囊腎、Ehlers Danlos綜合癥、Marfan綜合癥、Moyamoya病、肌纖維發育不良及鐮狀細胞病者；經神經影像學證實的梭形動脈瘤或顱內動脈夾層者或動靜脈畸形者；未取得患者或法定監護人知情同意者。

1.2 受試者臨床資料采集 記錄研究對象的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族史、既往史、用藥史等。記錄研究對象的高血壓病史。根據神經影像學資料（DSA、3D-CTA或MRA）記錄IA組IA的數量（單發IA和多發IA），并記錄IA組中單發IA者的IA部位（前循環、后循環及其它）。在記錄上述臨床資料的基礎上，再按性別分別記錄和統計。

1.3 研究位點選擇 參閱文獻，查找美國國家生物技術信息中心網站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/），根據Iternational HapMaP Project數據庫中CHB的基因組遺傳變異資料確定基因各SNP分布頻率。利用HaploView軟件中的Tag algorithm篩選標簽SNP（Tag SNPs）。優先選取位于蛋白編碼區可導致氨基酸序列改變、5'或3'非轉錄區、啟動子區等具有潛在功能學意義的位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區域4 個與血管疾病相關的SNP（rs1333040、rs2891168、rs2383207和rs10757278）作為研究位點。

1.4 基因多態性檢測 IA組和對照組每個受試者采集2～3 mL靜脈血，EDTA抗凝，應用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。將提取的人基因組DNA用紫外分光光度儀進行純度鑒定和定量分析。對所有研究對象的DNA應用TaqMan SNP基因分型檢測技術（ABI 7900）檢測上述位點的基因型。設計并合成本實驗所需的TaqMan探針，探針引物序列見表1。

表1 各SNP探針引物序列Tab.1 Primer sequences of SNP probes

PCR反應體系為：人基因組DNA 20 ng（1 μL），上下游引物各0.5 μL，probe-FAM和probe-VIC各0.2 μL，Taqman Genotyping Master Mix 10 μL，用ddH2O補足至20 μL。采用PCR自動擴增儀擴增。擴增條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，以60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環40次，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 統計學分析 獲得樣本個體基因型后，將所有結果數字化錄入數據庫，利用統計分析軟件包SPSS 13.0進行相關的統計分析。計數資料的比較采用χ2檢驗。計量資料的比較采用t檢驗?；蛐秃偷任换蝾l率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

應用χ2擬合優度檢驗分析IA組和對照組基因型頻率分布是否符合H-W平衡。假定p代表雙態遺傳標記的一個等位基因頻率，q代表另一個等位基因頻率，在一個隨機婚配群體中，基因型頻率分布應符合二項式分布：即(p+q)2＝p2＋2pq＋q2＝1。采用公式(1－Ho/He)2×n，Ho為觀察到的雜合子基因型頻率，He為期望值（He＝2pq），n為受檢個體數目，df＝1，如P＞0.05，則說明樣本符合H-W平衡。應用SPSS 13.0軟件包Logistic回歸模型中的二分類反應變量的Logistic回歸校正IA的危險因素（高血壓、吸煙及飲酒過量）及年齡的影響，探討基因型與漢族IA人群的相關性。利用多變量Logistic回歸分析研究上述臨床資料各分層（IA的數量分層及位分層）中CDKN2A-CDKN2B區域變異的頻率與對照組的差別。為評估性別差異性效應，將男性和女性的數據分別統計分析，并且在校正傳統危險因素的基礎上，在回歸模型中引入基因型*性別交互變量（interaction variable）進一步證實性別差異與基因型的關系。

2 結果

2.1 研究對象的臨床資料匯總 研究表明，與對照組相比，高血壓、大量飲酒與IA的發生相關（P＜0.05），是IA發生的危險因素（表2）。

表2 研究對象臨床資料一覽表Tab.2 List of clinical data of the subjects

2.2 所檢各SNP分型圖及基因型檢測結果 對IA組和對照組每個SNP基因型應用χ2擬合優度檢驗進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示上述兩組各SNP位點基因型頻率分布沒有偏離Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。說明本研究選取的樣本具有人群代表性，適合做遺傳學分析。

各SNP分型圖及基因型檢測結果如圖1（見封二）所示。

在rs1333040位點上，基因型頻率分布差異有統計學意義：IA組T/T基因型的頻率明顯高于對照組，C/C基因型的頻率明顯低于對照組，基因型頻率比較χ2＝7.934，P＝0.005，OR＝2.148, 95%CI1.255～3.675。在等位基因頻率比較中，IA組與對照組差異也有統計學意義：IA組T等位基因頻率（64.0%）明顯高于對照組（56.4%），C等位基因的頻率（36.0%）明顯低于對照組（43.6%），等位基因頻率與對照組比較χ2＝6.278，P＝0.012，OR＝1.378，95%CI1.072～1.771。說明rs1333040與漢族人群IA發病密切相關，其風險性主要來源于T等位基因。未發現CDKN2A-CDKN2B區域所檢其它SNP位點與漢族人群的IA發病相關（表3）。

表3 IA組與對照組SNPs基因型與等位基因頻率比較一覽表Tab.3 Comparison of SNPs genotype and allele frequency between IA group and control group

2.3 IA發生風險的多因素分析 如前所述，在IA組rs1333040位點的T/T基因型頻率明顯高于對照組，因此對rs1333040位點TT＋CT基因型行進一步統計學處理，與基因型C/C比較，應用Logistic回歸校正性別、年齡及其他環境危險因素（飲酒、吸煙等）后TT＋CT基因型頻率IA組和對照組比較差異仍然有統計學意義，提示rs1333040位點的TT基因型及T等位基因是IA的獨立危險因素，其患病風險率增加至1.796倍。多發IA和單發IA亞組比較發現，與上述各SNP位點的基因頻率分布均無明確相關。在亞組分析中，rs2891168位點上，不同基因型中患者的IA發生部位存在差別，其A/A基因型與前循環分布區的IA密切相關（P＝0.025）。未發現其它所檢SNP位點不同基因型的患者在IA發生部位上的差別。

2.4 按性別進行統計的亞組分析 在校正了年齡、血壓、吸煙、飲酒等影響因素后，rs1333040 T/T基因型與漢族男、女IA發病均密切相關，但與女性IA的關聯程度更高（表4）。

表4 IA患者SNPs基因型性別差異效應分析Tab.4 Analysis of sex differential effect of SNPs genotypes in IA patients

3 討論

近年來，國內外多數學者認為，IA的形成、發展和破裂是遺傳和環境因素共同作用的結果[2,7]。同其它血管疾病類似，其常見的危險因素為高血壓、吸煙及飲酒過量[8]。然而，迄今為止，人們對IA的分子生物學發病機制還知之甚少。

目前國際上針對歐洲和日本人群開展了關于IA的大樣本GWAS，并報道了數個與IA相關聯的區域，分別位于染色體18q11.2、13q13.1、10q24.32、8q11.23-q12.1以及9p21.3[7,9]。其中，有數項獨立研究發現位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區域不僅與北歐、日本人群的IA相關，而且與缺血性腦卒中、心肌梗死、腹主動脈瘤、2型糖尿病等多種血管疾病存在關聯[3-5]。雖然該區域的功能尚不明確，但有人推測位于該區域的假定危險基因可能與細胞周期分裂過程相關，在人體血管的形成和修復方面發揮著重要的作用[9]。因此，CDKN2A-CDKN2B被認為是最有希望發現IA等血管疾病關鍵性致病基因的區域之一[4,10]。

本研究證實了位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區域4 個與血管疾病相關的SNP位點（rs1333040、rs2891168、rs2383207和rs10757278）中，rs1333040與漢族人群IA發病密切相關，是IA的獨立危險因素。此外，本研究表明，rs1333040 T/T基因型與漢族男、女IA發病均密切相關，但與女性IA的關聯程度更高，提示基因和性別在IA發生中具有一定的影響作用。絕大多數年齡段（＜85 歲）的缺血性或出血性卒中，均為男性高發，這與男性具有更高的卒中危險因素（如吸煙、飲酒等），且內源性雌激素可能對卒中有保護作用有關[11-12]。然而，如前所述，SAH在流行病學方面卻具有與其它腦血管疾病截然不同的特點。其中最為突出的是，女性較男性更易發生SAH。迄今為止，女性易發生IA破裂導致SAH的機制尚不明確，國內外也罕有這方面的研究報道。Lin等[13]通過研究，證實染色體9p21對于亞臨床性動脈粥樣硬化存在性別差異性的遺傳效應，說明發病率的性別差異可能有其相應的遺傳學機制。本研究通過對CDKN2A-CDKN2B區域的關聯分析，從遺傳學角度進一步詮釋女性易患IA及SAH這一流行病學現象的原因，為IA流行病學研究提供了遺傳學依據，也為今后開展上述區域IA相關位點的功能研究奠定基礎，具有一定的臨床實用價值和應用前景。

但是，實現以基因為導向的IA及SAH個體化預防、診療仍然任重道遠。今后，在本研究的基礎上，可以在以下方面進一步深入探討：首先，本研究結果提示rs1333040與漢族人群IA發病密切相關，是IA的獨立危險因素。但腦血管病屬于多基因遺傳病，該SNP與其它易感基因之間是否存在交互作用尚不得而知，有待于將來進一步的研究加以證實。其次，腦血管病病因復雜，是由遺傳與環境共同作用而致病的。今后應建立環境-基因、基因-基因、基因-基因-環境交互作用的模型，進行多因素交互效應的探索分析，為IA的發生、發展和預后提供更為詳實和客觀的分子流行病學資料。此外，今后應開展上述區域IA相關位點的功能研究，明確上述SNP對相關蛋白表達以及功能的影響，從而為最終闡明IA的發病機制及遺傳易感性機理打下理論基礎。