總前列腺特異性抗原熒光免疫層析定量檢測試劑的研究及應用

朱利國，劉 云，陳永偉，施龍順，孫 萍，吳 國

（1.江蘇省原子醫學研究所附屬江原醫院，江蘇 無錫 214063；2.江蘇省原子醫學研究所，江蘇 無錫 214063；3.國藥東風總醫院，湖北 十堰 442000）

前列腺疾病是我國中老年男性泌尿系統中的一種常見疾病。目前，我國已經步入老齡化，前列腺疾病不僅在中老年中高發多見，而且有年輕化趨向。在臨床上前列腺特異性抗原（tPSA）常常被用作早期發現、早期篩查前列腺癌的重要指標[1-2]。目前常見的tPSA方法學檢測主要有ELISA、化學發光免疫分析（CLIA）、電化學發光免疫分析（ECLIA）、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）等。這幾種方法都存在操作步驟繁瑣且反應時間較長的共性問題，我們研發的tPSA熒光免疫層析定量檢測方法，可以有效地縮短樣本檢測時間[3-4]，以便更好地為臨床服務。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月—2019年5月于江蘇省江原醫院門診、住院就診患者和體檢中心體檢人群90 名，年齡38～83 歲，均為男性，晨起空腹抽取3 mL血液，分離血清后備用。

1.2 試劑與儀器 標記兩株不同點位的抗tPSA抗體L1、檢測抗體C1、質控抗體Q1（羊抗鼠IgG）、熒光微球、tPSA標準品、AFP標準品均來自無錫市江原實業技貿公司；ECLIA tPSA試劑盒、tPSA質控品均為羅氏公司產品；CA199標準品，為達安公司產品；硝酸纖維素膜來自美國Merck-Millipore公司；樣品墊、聚酯膜、底板、吸水紙采購于上海杰一公司；其他試劑為國產分析純；HG-98免疫熒光檢測儀為上?；焦井a品。

1.3 制備方法

1.3.1 抗體標記熒光微球：使用pH 7.2～7.6的MES活化緩沖液洗滌熒光微球，加入碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫反應20～30 min，洗滌熒光微球，用0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入標記抗體L1，室溫反應2 h，加入含有10% BSA的0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應30 min，洗滌熒光微球，用含有1% BSA，0.1% Tween-20，0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液復溶至原體積，定量噴涂于聚酯膜上，避光35 ℃～38 ℃烘干1 h，加入干燥劑封存備用。

1.3.2 熒光免疫層析試紙條組裝部件處理：(1)樣品墊的處理：使用含1%BSA、0.1%Triton100的0.02 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品烘干。(2)包被膜的制備：使用含1%蔗糖的0.02 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，分別將檢測抗體C1和質控抗體Q1稀釋到1 mg/mL，將二者以0.5 cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，烘干后加入干燥劑封存備用。

1.3.3 熒光免疫層析試紙條的組裝：在濕度小于35%，穩定20 ℃～25 ℃的環境下，在PVC底板上黏貼上包被膜、結合了熒光微球標記的結合墊、樣品墊和吸水紙形成微濾體系，切割成0.3 cm寬，裝入卡殼中即制成試紙條（圖1）。

1.4 檢測方法 用加樣器將20 μL血清標本或標準參考品加入測試卡加樣孔中，同時加入50 μL樣品稀釋液，加樣孔朝外放入孵育器中。連接電源，打開檢測主機，膜層析反應15 min，運行儀器，儀器通過相應的分析軟件自動計算出待測樣本中的tPSA濃度。

標準曲線的繪制：將tPSA標準品制成6個不同的濃度，分別為0、2、4、10、50、100 ng/mL，每個濃度做5個平行樣。膜層析反應15 min后，儀器讀取T、C線信號。

與ECLIA檢測試劑盒比較：按ECLIA試劑盒要求將90份血清標本與免疫層析法同時進行平行檢測。

1.5 統計學處理 應用SPSS 12.0統計軟件對數據進行分析。

2 結果

2.1 檢測結果判讀 檢測時，液體在層析作用下前移動，若血清標本中tPSA的含量過少，試樣中的tPSA與結合墊上標記抗體L1結合的熒光微球結合形成復合物C1則相應較少，結合墊中的標記抗體L1與C線上的質控抗體Q1大量結合，因此T線將比C線熒光值低很多，結果為陰性；若試樣中tPSA的濃度較大，則復合物C1相應較多，與T線處的檢測抗體C1結合并大量形成抗體-抗原-抗體復合物C2，而且試樣中tPSA越高, T線熒光值越高，結果為陽性。無論是陽性還是陰性結果，因鼠源性抗體標記的熒光微球過量包被，因而總有未結合檢測抗體C1的部分熒光微球與C線處的羊抗鼠IgG結合，在C線處出現熒光微球的聚集。如果C線沒有出現熒光計數，無論T線有無熒光條帶，結果均無效（圖1）。

圖1 tPSA熒光免疫層析檢測試紙結構圖

2.2 標準曲線繪制 按照統計學方法，以檢測樣品熒光值信號為縱坐標，tPSA標準品濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線（圖2）。該標準曲線的R2為0.9779，線性較好，符合定量檢測的要求。

圖2 tPSA熒光免疫層析試紙條標準曲線

2.3 tPSA免疫層析熒光試紙條性能評價 (1)靈敏度：重復測定零劑量點（20 次），以±2s的熒光值在標準曲線上得到的相應值為檢測低限，相對應的檢測靈敏度平均值為0.02 ng/mL。(2)穩定性和精密度：免疫層析熒光試紙條法檢測tPSA高、低兩個質控品濃度（39.6 ng/mL，4.26 ng/mL）的批內和批間CV（n＝10）。結果顯示，批內CV為3.86%、4.68%，平均批內CV為4.27%，批間CV為6.22%、7.5%，平均批間CV為6.86%，均低于10%，表明免疫層析熒光試紙條法檢測tPSA精密度良好。同一批試劑4 ℃放置6 個月后，熒光計數無明顯變化（P＞0.05），說明該方法穩定性較好。(3)準確度：用10 ng/mL的標準品分別加入到含量為1.980、4.58、15.66 ng/mL的血清中進行回收試驗，回收率分別為105.2%、101.3%、98.1%；平均回收率為101.5%。(4)特異性：將1 000 U/mL的AFP、500 ng/mL的CEA高濃度標準品作為樣品，用tPSA免疫熒光層析試紙條進行檢測，各濃度點測定值分別為1.82 ng/mL、1.02ng/mL，說明兩者無交叉反應，方法特異性好。

2.4 與ECLIA方法的比較 按ECLIA試劑盒要求將90 份血清標本與免疫層析法同時進行平行檢測并對所有檢測數據進行分析。結果表明，免疫層析試紙條與ECLIA試劑盒的相關系數為R2＝0.9945（圖3），平均相對偏倚為18.39%，兩種方法高度相關；ECLIA試劑盒CUT-off值為4.0 ng/mL，其中ECLIA試劑盒檢測出的陽性血清標本采用熒光免疫層析試紙檢測均為陽性。

圖3 熒光免疫檢測試紙條-ECLIA試劑盒相關性

3 討論

tPSA是一種蛋白酶[5]，主要由前列腺腺泡、導管細胞分泌，具有提高精子活力和液化精液的效果。由于屏障隔離的原因，正常情況下tPSA在血液中含量極少，但當前列腺發生病變時可引起血液中tPSA含量增高，所以tPSA可作為一種有效標志物。tPSA具有前列腺器官的特異性，但tPSA非前列腺特異性抗原，不具有相應的腫瘤特異性[6-7]，良性前列腺疾病和惡性前列腺疾病都可以讓患者的tPSA水平升高，但tPSA仍然具有較好的臨床應用價值，被臨床作為一種穩定有效的早期篩查方法，在病變早期、療效評價、預后判斷等方面發揮重要作用。由于多數前列腺癌患者早期常無特異性的臨床表現，僅在臨床超聲檢查或外科直腸指檢時偶然發現，經直腸穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標準，但有一定的漏診率，患者臨床檢查的依從性相對較低。血清tPSA的檢測操作簡單，對病人而言沒有痛苦，檢查的依從性較好，建議45 歲以上的男性應當進行血清tPSA的常規普查，特別可以用于特定人群的篩查。

目前常見的tPSA方法學檢測主要有ELISA、CLIA、ECLIA、TRFIA等，以上幾種檢測方法均具備較高的靈敏度和準確性，但對醫療機構而言都具有耗時長、操作相對繁瑣等缺點，單項檢測成本高昂，手工操作容易產生人為誤差，儀器設備的高投入及對操作人員的高要求一定程度上限制了其在臨床的應用。我們開發研制的tPSA熒光免疫層析試紙條能夠符合床旁檢測（point of care test, POCT）要求，具有較高的靈敏度，精密度良好（批內、批間誤差?。?，與ECLIA法檢測所得結果沒有顯著差異（R2＝0.9945），但是操作簡單，快速、靈敏。檢測儀器體積小、便于攜帶，試劑易于保存，完全符合POCT的臨床應用要求[8]。本方法采用雙抗體夾心檢測反應模式，將標記抗體的熒光納米微球作為示蹤物，噴涂在結合墊上，另一抗體固定于試紙的T線區，滴加樣本后在層析作用下移至結合墊，形成熒光微球-抗抗體-抗體，繼續層析至T線區，被固定在T線區的抗體捕獲，形成熒光微球-抗抗體-抗體-抗抗體復合物，通過檢測熒光強度比對標準曲線就可以得到相應的血清標本濃度。

采用該熒光免疫層析試紙條可實現簡便、快速、單人份定量檢測，更適應臨床檢驗特別是基層醫療機構的臨床篩查需求，同時實現檢測儀器和試劑的產業化，達到較好的社會效益和經濟效益，值得臨床推廣應用。