EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導的AP-1 信號通路的機制研究

宋丹丹，那 雷，王曉鈞

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

TRIM5α 是TRIM 蛋白家族的重要成員之一。TRIM 蛋白家族是三結構域家族，包括N 端RING 鋅指結構、B-box 結構和一個卷曲螺旋結構（Coiled coil，CC）。這3 個結構簡稱為RBCC 結構域。除了RBCC 結構域外，TRIM5α C 端還有一個B30.2（SPRY）結構域。TRIM5α是一種限制逆轉錄病毒跨種間感染的宿主蛋白，其SPRY 結構域特異性結合逆轉錄病毒的衣殼蛋白，加速衣殼解體，導致病毒反轉錄復合體降解，進而阻礙病毒復制過程。同時，TRIM5α也作為一種模式識別受體，特異性識別逆轉錄病毒的衣殼蛋白所形成的網格結構，招募E2 泛素結合酶復合體UBC13-UEV1A，催化形成游離的K63 多聚泛素鏈，在TAB2、TAB3 作用下活化TAK1，最終通過激酶級聯反應激活AP-1和NF-κB信號通路，抑制病毒復制[1-2]。本實驗室已經證明恒河猴TRIM5α激活AP-1 信號通路除了依賴于RING 結構域外，還需要完整的SPRY 結構域[3]。雖然馬TRIM5α（eqTRIM5α）不具有完整的SPRY 結構域，但在293T 細胞中過表達的eqTRIM5α可以利用人源相關信號轉導蛋白強烈激活AP-1 和NF-κB 信號通路[4]。

本實驗室前期已經篩選到EIAV 的Rev 蛋白可以負調控宿主eqTRIM5α介導的AP-1信號通路，但是其機制還不清楚。本研究將pcDNA3.1-EIAV-Rev-HA 質粒分別與含eqTRIM5α及下游信號轉導蛋白TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 基 因 的 質 粒 共 轉 染HEK 293T 細胞，利用熒光素酶報告試驗及western blot 試驗，證明EIAV 的Rev 蛋白顯著下調eqTRIM5α介導的AP-1 信號通路，是通過蛋白酶體途徑特異性降解P38 蛋白完成，本研究為進一步理解EIAV 與宿主蛋白相互作用及病毒逃逸機制提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞 pcDNA3.1-TAK1-Flag（簡稱pTAK1-Flag，全文pcDNA3.1 載體均按該簡稱）、pTAB2-Flag 和pc-Jun 真核表達質粒由瑞士日內瓦大學Luban 教授惠贈；pGL3-AP-1-Luc 報告質粒、pRL-TK內 參 質 粒、pcDNA3.1、peqTRIM5α-HA、pEIAVRev-HA、pP38-Flag 質粒和HEK 293T 細胞均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Polyjet 轉染試劑購自SignaGen Laboratories公司；鼠抗Flag單克隆抗體（MAb）購自OriGene公司；鼠抗HA MAb、鼠抗β-actin MAb、蛋白酶體抑制劑MG132、DMSO 均購自Sigma 公司；IRDye800CW標記的羊抗鼠IgG 購自KPL 公司；雙熒光素酶報告系統購自Promega 公司；細胞裂解液1（150 mmol/L Tris-Cl、 50 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、 1%Triton X-100，PH=7.6）、細 胞 裂 解 液2（50 mmol/L HEPES、50 mmol/L KCl、0.25%NP-40、1 mmol/L DTT、100 mmol/L NaCl，PH=7.9）均由本實驗室配制。

1.3 EIAV Rev 對eqTRIM5α激活的AP-1 信號通路的檢測 待12 孔板中的HEK 293T 細胞培養至細胞融合度80%時，參照Polyjet 轉染試劑說明書，第一組轉染900 ng pcDNA3.1 空載體質粒為陰性對照；第二組共轉染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ng pcDNA3.1質粒；第3 組共轉染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ngpEIAV-Rev-HA 質粒；第4 組共轉染450 ng pEIAVRev-HA+450 ng pcDNA3.1 質粒，上述各組均同時轉染100 ng pGL3-AP-1-Luc（報告質粒）和5 ng pRL-TK（內參質粒）。每組分別做3 個重復。轉染24 h 后，兩個重復組棄去上清液，每孔加100 μL 細胞裂解液1，4 ℃裂解10 min，室溫振蕩10 min。每孔分別取10 μL 上清液于微孔板中，參照Promega 說明書，利用雙熒光素酶報告系統檢測每組螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性值，兩者的活性比值即為每組所得數值，采用GraphPad Prism 5 分析數值。同時，為了證明每組質粒均轉染成功，轉染24 h 后，每組的第三個重復組棄去上清液，每孔加入200 μL 細胞裂解液2，離心收集裂解物上清，分別以鼠抗HA MAb（1∶10 000）、鼠抗Flag MAb（1∶2 000）、鼠抗β-actin MAb（1∶20 000）為一抗室溫孵育2 h，以IRDye800CW 標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗室溫避光孵育1 h，利用western blot 對每組蛋白表達情況進行檢測。利用Image Studio Lite Ver 5.2 軟件進行灰度分析，檢測eqTRIM5α、EIAV Rev 蛋白及β-actin的表達情況。

1.4 EIAV Rev 對TRIM5α下游轉導分子（TAK1、TAB2、P38、c-Jun）激活的AP-1 信號通路的檢測該部分設置4 個轉染試驗，每個實驗設置4 個組。第1 個轉染試驗設置如下：第一組轉染900 ng pcDNA3.1 作為陰性對照；第二組共轉染450 ng pcDNA3.1+450 ng pTAK1-Flag質粒；第三組共轉染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pTAK1-Flag 質 粒；第4 組 共轉染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pcDNA3.1 質粒。第2 個轉染試驗設置如下：第1、4 組同第一個轉染試驗；第2 組共轉染450 ng pcDNA3.1+450 ng pP38-Flag 質粒；第3 組共轉染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pP38-Flag 質粒。第3 個轉染試驗設置如下：第1、4 組同第一個轉染實驗；第2 組共轉染450 ng pcDNA3.1+450 ng pP38-Flag質粒；第3組共轉染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pP38-Flag 質 粒。第4 個 轉 染試驗設置如下：第1、4 組同第一個轉染試驗；第2組共轉染450 ng pcDNA3.1+450 ng pc-Jun 質粒；第3組共轉染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pc-Jun 質粒。上述各試驗每組均同時轉染100 ng pGL3-AP-1-Luc（報告質粒）和5 ng pRL-TK（內參質粒）。每組分別做3 個重復。轉染24 h 后裂解細胞，裂解方法、熒光素酶檢測方法和western blot 方法與1.3 中各方法一致。

1.5 EIAV Rev 對TRIM5α 下游轉導分子激活的western blot 檢測 待6 孔板中的HEK 293T 細胞培養至細胞融合度80%時，參照Polyjet 轉染試劑說明書，第一孔共轉染1 μg pTAK1-Flag+1 μg pcDNA3.1質粒；第二孔共轉染1 μg pTAK1-Flag+1 μg pEIAVRev-HA 質粒；第3 孔共轉染1 μg pTAB2-Flag+1 μg pcDNA3.1 質粒；第4 孔共轉染1 μg pTAB2-Flag+1 μg pEIAV-Rev-HA 質粒；第5 孔共轉染1 μg pP38-Flag+1 μg pcDNA3.1 質粒；第6 孔共轉染1 μg pP38-Flag+1 μg pEIAV-Rev-HA 質 粒。每 孔 分 別 做3 個 重 復。轉染24 h 后，棄去上清液，每孔加入200 μL 細胞裂解液2，離心收集裂解物上清，分別以鼠抗HA MAb（1∶10 000）、鼠抗Flag MAb（1∶2 000）、鼠抗β-actin MAb（1∶20 000）為一抗室溫孵育2 h，以IRDye800CW標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗室溫避光孵育1 h，經western blot 檢 測TAK1、TAB2、P38、EIAV Rev 蛋白及β-actin 的表達情況，并經Image Studio Lite Ver 5.2 軟件進行灰度分析。

1.6 蛋白酶體抑制劑恢復試驗 待6 孔板中的HEK 293T 細胞培養至細胞融合度80%時，利用Polyjet轉染試劑分別共轉染1 μg pP38-Flag+1 μg pEIAVRev-HA（分 別 作 為 兩 個 實 驗 組2 和3）和1 μg pP38-Flag+1 μg pcDNA3.1（作為陰性對照組1）。轉染24 h 后，實驗3 組加入20 μmol/L 蛋白酶體抑制劑MG132，實驗2組和陰性對照組分別加入相同濃度DMSO，作用24 h 后按1.3 的western blot 方法分別檢測P38、EIAV Rev 蛋白及β-actin 蛋白表達。

1.7 統計分析 整理數據，按照T-test 統計方法對上述試驗得到的數據進行顯著性分析，p＜0.05 或p＜0.01 具有統計學差異。

2 結 果

2.1 EIAV Rev 對eqTRIM5α激活的AP-1 信號通路的檢測結果 為了探究EIAV Rev 蛋白影響eqTRIM5α激活的AP-1 信號通路的機制，本試驗通過熒光素酶系統檢測EIAV Rev 蛋白對eqTRIM5α激活的AP-1信號通路的影響。結果顯示：eqTRIM5α 與pcDNA3.1 共轉染后激活AP-1 信號通路的倍數為26.0；eqTRIM5α與EIAV Rev 共轉染后激活AP-1 信號通路的倍數為0.4；單轉染pcDNA3.1 和共轉染EIAV Rev和pcDNA3.1后激活AP-1信號通路的倍數分別為1.0和0.8（圖1A）。Western blot 試驗結果顯示：eqTRIM5α、EIAV Rev 蛋白大小分別為40 ku、20 ku，與預期大小一致（圖1B），表明熒光素酶試驗結果成立。熒光素酶試驗表明eqTRIM5α 可以激活AP-1 信號通路，而EIAV Rev 則顯著抑制eqTRIM5α對AP-1 的激活作用（p＜0.01）。

2.2 EIAV Rev 對TRIM5α 下游轉導分子（TAK1、TAB2、P38、c-Jun）激活的AP-1 信號通路的檢測結果 為了進一步研究EIAV Rev 負調控TRIM5α激活AP-1 信號通路的分子機制，本試驗利用AP-1 雙熒光素酶報告系統檢測EIAV Rev 對TRIM5α下游重要信號轉導分子TAK1、TAB2、P38、c-Jun 激活的AP-1 信號通路的影響。結果顯示，實驗組pEIAV-Rev-HA+pTAK1 組、pEIAV-Rev-HA+pTAB2 組、pEIAV-Rev-HA+pP38 組 和pEIAV-Rev-HA+pc-Jun 組 對AP-1 信號通路的激活倍數分別為7.7、0.1、0.6、9.8；對照組pTAK1+pcDNA3.1 組、pTAB2+pcDNA3.1 組、pP38+pcDNA3.1 組和pc-Jun+pcDNA3.1 組對AP-1 信號通路的激活倍數分別為60.0、1.5、6.3 及12.0；單轉染pcDNA3.1 和 轉 染pEIAV-Rev-HA+pcDNA3.1 后 對AP-1 信號通路的激活倍數分別為1.0 和0.8?？梢?，EIAV Rev 對TAK1、TAB2、P38 介導的AP-1 信號通路的激活作用分別下調了87%、93%、90%，而對于c-Jun 激活的AP-1 信號通路無明顯影響（p＞0.05）（圖2A、2B、2C、2D）。Western blot 試 驗 結 果 顯 示：EIAV Rev、TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 蛋白大小分別約為20 ku、78 ku、80 ku、40 ku 和43 ku，與預期大小一致（圖2E、2F、2G、2H），表明各蛋白均在293T細胞中得到了表達，熒光素酶試驗結果成立。熒光素酶試驗結果表明，EIAV Rev 對TAK1、TAB2、P38 介導的AP-1信號通路均有下調作用，而其對c-Jun激活的AP-1 信號通路的下調作用無明顯影響。

圖2 EIAV Rev 對TAK1（A、E）、TAB2（B、F）、P38（C、G）、c-Jun（D、H）激活的AP-1 熒光素酶試驗和western blot 試驗結果Fig.2 Effect of EIAV Rev protein on AP-1 luciferase activity and western blot activated by TAK1(A/E),TAB2(B/F),P38(C/G)and c-Jun（D/H）

2.3 EIAV Rev 對TRIM5α下游信號轉導因子（TAK1、TAB2、P38）蛋白表達水平的影響 為了進一步確定EIAV Rev 是否通過影響P38 蛋白表達而發揮對AP-1 信號通路的負調控作用，本研究通過共轉染試驗經western blot 檢測細胞中EIAVRev、TAK1、TAB2和P38 的表達，以β-actin 為內參對照。結果顯示，EIAV Rev、TAK1、TAB2和P38分別約為20 ku、78 ku、80 ku、40 ku，與預期大小一致，而pEIAV-Rev-HA+pP38-Flag 組 與pcDNA3.1+pP38-Flag 組 相 比，前者的P38 蛋白表達顯著減少（圖3A）?；叶确治鼋Y果顯示，在過表達P38 的基礎上，轉染pEIAV-Rev-HA（Rev+）與未轉染pEIAV-Rev-HA（Rev-）相比，EIAV Rev 顯著降低P38 蛋白的表達水平；在共轉染TAK1、TAB2 的基礎上，轉染Rev+與Rev-均對TAK1 和TAB2 蛋白水平無明顯影響（圖3B）。結果表明，EIAV Rev 通過下調P38 蛋白表達發揮對AP-1 信號通路的負調控作用。

2.4 蛋白酶體抑制劑恢復試驗結果 為了明確EIAV Rev 對P38 蛋白的下調作用是否由蛋白酶的降解造成的，本研究將共轉染pP38-Flag+pEIAVRev-HA 的兩個實驗組在轉染24 h 后分別加入蛋白酶體抑制劑MG132 和DMSO（作為對照組），陰性對照組（pP38-Flag+pcDNA3.1 組）加入DMSO，作用24 h后經western blot 檢測。結果顯示，實驗組中加MG132 組與只加DMSO 組相比，MG132 恢復了過表達Rev 后P38 蛋白的表達，且表達水平與陰性對照組一致（圖4A）?；叶确治鼋Y果顯示，加入MG132之后，P38 蛋白的表達量增加（圖4B）。結果表明，EIAV Rev 蛋白是通過蛋白酶體途徑降解P38 蛋白從而下調P38 蛋白的表達。

圖3 EIAV Rev 對TRIM5α下游信號轉導因子表達的影響（A）及灰度分析（B）Fig.3 Effect of EIAV Rev on the expression of TRIM5α down stream signal transduction factor(A)and grayscale analysis(B)

圖4 MG132 對P38 表達的恢復效果（A）及灰度分析（B）Fig.4 Effect of MG132 on P38 expression(A)and grayscale analysis(B)

3 討 論

TRIM5α是逆轉錄病毒衣殼的細胞內模式識別受體，通過SPRY 結構域特異性識別逆轉錄病毒的衣殼蛋白所形成的網格結構，招募泛素結合酶復合體UBC13-UEV1A，并在其作用下催化形成游離的K63多聚泛素鏈，進而在TAB2、TAB3 作用下活化TAK1，通過激酶級聯反應激活AP-1和NF-κB信號通路，使細胞處于抗病毒狀態[1]。不同種屬的TRIM5α基因翻譯的蛋白結構差異很大，犬和貓的TRIM5α基因是不完整的，不具有抗病毒活性，研究報道TRIM5α需要通過SPRY結構域結合病毒衣殼蛋白從而發揮抗病毒功能[5-7]。本實驗室前期報道eqTRIM5α蛋白不具有完整的SPRY 結構域，但過表達eqTRIM5α在293T 細胞中仍然可以抗EIAV 的感染[8]，也證明了過表達eqTRIM5α在293T 細胞中可以很好的激活天然免疫應答，推測eqTRIM5α抗EIAV 活性依賴于其激活的天然免疫。

EIAV 隸屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬，主要感染馬巨噬細胞，導致馬持續感染和反復的病毒血癥[9]，對馬行業影響重大。EIAV 是基因組最為簡單的慢病毒且能造成潛伏感染，至今發現其僅包含Gag、Pol、Env 3 個結構蛋白以及Tat、Rev、S2 3 個輔助蛋白。本實驗室前期以EIAV 為模型病毒通過熒光素酶試驗篩選到Rev 蛋白，并且首次發現Rev 蛋白可以顯著下調eqTRIM5α激活的AP-1 信號通路。Rev蛋白是EIAV 的重要輔助蛋白之一，主要承擔在病毒復制晚期向核外轉運未完全剪切的mRNA 的作用，以促進病毒的組裝[10]。該蛋白全長為165 個氨基酸，主要包括精氨酸富集區、核定位信號、核輸出信號、RNA 結合域（ARM）[11]。

為探究Rev 蛋白負調控eqTRIM5α激活的AP-1信號通路的具體階段，將pcDNA3.1-EIAV-Rev-HA分別與TRIM5α 下游關鍵轉導蛋白TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 基因的質粒及AP-1 熒光素酶報告系統共轉染HEK 293T 細胞。結果顯示EIAV-Rev 顯著抑制TAK1、TAB2 和P38 激活的AP-1 通路，而對c-Jun 激活的AP-1 通路無明顯影響，表明EIAV-Rev 對TRIM5α激活的AP-1 通路的負調控作用發生在p38 與c-Jun 之間。進一步的western blot 試驗表明EIAVRev 顯著抑制p38 蛋白的表達。并且加入蛋白酶體抑制劑MG132 則恢復了p38 蛋白的表達，表明EIAV Rev 蛋白通過蛋白酶體途徑降解P38 蛋白，導致依賴于P38 蛋白的AP-1 信號通路的負調控作用。但是，Rev 怎樣直接或間接導致P38 蛋白的降解有待于進一步研究，本實驗為進一步理解EIAV 與宿主的相互作用提供實驗依據。