δD，δ18O和δ13C同位素比率質譜法在鮮榨蘋果汁鑒偽中的應用

雷佳蕾，田丹，薛佳，2，3,4，鄧紅，3，4*，孟永宏，3，4，郭玉蓉，3，4

1(陜西師范大學，食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119) 2(農業部都市農業重點實驗室，上海，200240) 3(國家蘋果加工技術研發專業中心，陜西 西安，710119) 4(西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西 西安，710119)

中國的蘋果產量居世界首位，蘋果汁是其重要的加工制品之一，按照工藝不同可分為濃縮還原汁和非濃縮還原汁(包括鮮榨汁)兩大類[1]。鮮榨蘋果汁(fresh apple juice，FAJ)是由新鮮蘋果直接壓榨后滅菌制成的果汁，因其果汁口感還有營養價值接近鮮果而成為一種健康飲品和消費趨勢，有巨大的市場需求和高昂的售價[2]。

目前，全球每年消耗超過1 600萬t的果汁，鮮榨蘋果汁的優勢使它成為摻假的目標，市場中存在用濃縮汁加水復原(from concentrate，FC)代替鮮榨蘋果汁或是在鮮榨蘋果汁中摻入FC果汁進行銷售的現象[3]，因此，鮮榨蘋果汁的真實性一直是政府機構關注的問題。同時消費者對食品的安全性和真實性的要求越來越高，為了確保公平的市場競爭并促進國際貿易，保障消費者的利益，急需開發一種能夠檢測鮮榨蘋果汁真實性的技術。

但蘋果汁真空濃縮過程中化學成分變化不大，傳統物理和化學分析方法以及果汁的糖度、酸度、可溶性固形物、pH值等指標的對比也不能夠輕易地區分鮮榨蘋果汁與濃縮復原汁[4]。而近10年來穩定同位素技術已發展成為解決食品摻假問題的一個強有力的手段[5]，某些同位素分析方法已經獲得了美國分析化學師協會(Association of Official Agricultural Chemists, AOAC)及歐盟標準化委員會(Comité Européen de Normalisation, CEN)的認可(如ENV 12141 和 ENV 12142)[6-7]。同位素(isotope)指的是具有相同質子數和不同中子數的一類元素的總稱，可以分為穩定性同位素和放射性同位素。穩定同位素分析法是一種對摻假果汁進行快速、準確鑒別的有效方法，鑒別果汁真實性經常用到的同位素是碳同位素、氫同位素和氧同位素[8-9]。許多研究[10-12]發現，果汁經過水分蒸發達到濃縮的目的，并會富集δD 和δ18O，在濃縮汁中加水還原后制成的果汁中δD 和δ18O 低于原來的果汁，并且這種果汁中δD 和δ18O與加水量呈負相關性關系；因此可以運用穩定氫氧同位素鑒別鮮榨蘋果汁與濃縮復原果汁。此外δ13C值的應用研究表明[13-15]，不同來源的多種糖組分其δ13C 值有一定的范圍，且碳同位素比值不同，差值在 1‰以上就屬于明顯差別，所以利用δ13C 值可以判別鮮榨蘋果汁中外源糖摻假的問題。

目前穩定同位素比率分析在我國食品科學領域應用較多，但在蘋果鮮榨汁鑒偽上應用較少，除了牛麗影等[4]的研究還沒有其他報道。本文以多個品種蘋果為原料，在制備鮮榨汁、濃縮汁和摻假蘋果汁的基礎上，采用同位素比率質譜法(isotope ratio mass spectrometry，IRMS)對不同品種蘋果鮮榨汁和摻假蘋果汁的δD、δ18O、δ13C值進行了分析，通過同時使用水的δD，δ18O和外源糖中的δ13C來識別鮮榨蘋果汁的摻假問題。本研究旨在建立一種通過IRMS識別鮮榨蘋果汁的快速方法，從而為鮮榨蘋果汁的可追溯性和真實性提供解決方案，對促進我國果汁出口也具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 原材料與試劑

不同品種的蘋果(表1),中國陜西白水現代蘋果產業協同創新研究所；匯源蘋果汁、榮士蘋果汁,華潤萬家超市;其他果糖、葡萄糖和二糖、寡糖等均為分析純，西安晶博生物科技有限公司。水取自西安長安區的自來水，經處理后符合國家標準(GB 5749-2006 生活飲用水衛生標準)。標準平均海洋水(standard mean ocean water，SMOW)的同位素豐度比值為 D/H=(155.76±0.10)×10-6；δ18O/δ16O=(2 005.20±0.43)×10-6。

表1 試驗研究用蘋果品種Table 1 Apple cultivars used in this study

1.2 儀器設備

WF-A2000榨汁機，浙江永康市偉豐電器廠；SC-3610高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；N-1100旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；微蒸餾裝置，實驗室自行安裝[4]；DLT-100 LGR液態水同位素分析儀，美國Los Gatos Research公司；HPLC-co-IRMS高效液相色譜儀、同位素比率質譜聯用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 FAJ的制備

每個品種取3～4個新鮮蘋果來制備FAJ。將清洗、去核的蘋果投入家用榨汁機中榨汁，然后將其灌裝入25 mL具塞試管中，在90 ℃下滅菌1 min，將果汁樣品在-20 ℃下冷凍保存，進行同位素分析時于室溫下解凍使用。

1.3.2 摻假蘋果汁(adulterated apple juice，AAJ)的制備

市售摻假果汁常用的方法是在果汁中添加水、糖和酸來冒充，為進行對比分析，實驗制備了2種摻假果汁。第1種是添加外源水的摻假果汁，即將鮮榨蘋果汁在65 ℃下真空濃縮至70 °Brix，然后加水將其稀釋至鮮榨蘋果汁的濃度(°Brix)，巴氏滅菌后制成FC蘋果汁。將FAJ和FC蘋果汁以體積比0∶10、2∶8、4∶6、6∶4和8∶2、10∶0的比例混合，制成摻假程度為100%、80%、60%、40%和20%、0%的摻假果汁，以檢查同位素方法的適用性并減少蘋果品種的影響，定量確定外源水百分比的δD值。第2種是添加的外源糖的摻假果汁，即將質量分數0.1%，0.5%和2.5%的蔗糖添加到鮮榨蘋果汁中并加水調節其濃度(°Brix)與鮮榨蘋果汁相同，制成摻假果汁。

1.3.3 C、H和O同位素比(δ13C，δD和δ18O)的檢測分析

1.3.3.1 δD、δ18O的分析

自然界中重同位素與輕同位素的比值(分餾系數)很小，所以對于水中的H、O同位素組成一般采用相對于 SMOW的千分差表示，當 δD 和 δ18O 為正值時， 表示樣品與SMOW相比富集了 D 和18O；當 δD 和 δ18O 為負值時，表明樣品中的2種同位素比SMOW標準中的虧缺。δD 和 δ18O 的測定分別按照 ENV 12141(1997)與 ENV 12142(1997)方法和相關文獻[10-12]進行。

微蒸餾法制備樣品：將 20 mL蘋果汁樣品放入50 mL蒸餾瓶中，并使用電加熱套加熱，溫度控制在120 ℃；來自蒸餾瓶的蒸汽通過冷凝器冷凝并收集在試管中，試管被放置在裝有少量液氮的保溫杯中。當蒸餾瓶中蘋果汁的殘留量為2 mL時，停止加熱，取出試管并在-80 ℃的冰箱中快速密封保存，25 ℃解凍后用于進樣分析。

同位素分析：δD和δ18O的測量是在液態水同位素分析儀進行，該儀器是根據離軸積分腔輸出光譜原理設計以用于分析樣品中的同位素比。微蒸餾樣品通過0.45 μm過濾器過濾后進樣分析。氫同位素比(D/H)以千分之一(‰)表示，18O/16O的測量重復性標準偏差為<0.2‰，D/H的測量誤差為<0.6‰。所有樣品均在相同的實驗條件下測量。通過相對于標準平均海水的千分之一(‰)計算出試驗樣品δD和δ18O的同位素比，如公式(1)所示，其準確度分別為0.5‰和0.15‰[16]。

(1)

其中:R樣品,水樣品中D/H或18O/16O的比率;RSMOW,標準水樣品(SMOW)D/H或18O/16O的比率。

1.3.3.2 δ13C的分析

樣品準備：5種鮮榨蘋果汁，3種摻有白砂糖的實驗室自制摻假蘋果汁，2種市售蘋果汁(commercial apple juice，CAJ)的樣品，將每個樣品稀釋30倍并過濾至2 mL小瓶中。

同位素分析[13,17]：δ13C的同位素分析在同位素比率質譜聯用的高效液相色譜儀(HPLC-co-IRMS)上進行；色譜柱： Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+(7.8 mm×300 mm)；柱溫80 ℃；流動相水；流速350 μL/min；氧化劑1.1 mol/L過二硫酸鈉溶液和0.3 mol/L H3PO4；流速50 μL/min；氧化反應溫度99.9 ℃；進樣體積9、25 μL，分別用于果糖、葡萄糖和二糖、寡糖、有機酸的測定計算。電子轟擊離子源(EI)：He壓力為400 kPa；CO2壓力為50 kPa；離子源電壓3.06 kV；真空度0.18 mPa。

通過Isolate 3.0軟件分析和計算樣品的δ13C值。δ13C值是根據國際標準物質Vienna pee dee belemnite standard(VPDB)計算得到，如公式(2)所示：

(2)

式中:R樣品為樣品的13C和12C同位素比，RVPDB=0.011 237 2；HPLC-co-IRMS的檢出限為0.7%。當某物質的百分比小于0.7%時，視為該物質未檢出。

1.4 統計分析

所有樣品均重復3次，所有圖表均使用Graph Pad Prism 5完成，采用SPSS 18.0進行統計分析。表中的數據顯示為平均值±標準偏差，且使用單因素方差分析分析圖中的數據，并使用相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)<2%來分離均值。

2 結果與分析

2.1 不同果汁中水的δD和δ18O值比較

2.1.1 FAJ和AAJ水中δ18O的特征

圖1-a表示不同品種蘋果汁水的δ18O值隨摻假度的變化。

a-不同品種蘋果汁中水的δ18O值隨摻假度的變化;b-不同品種FAJ和100% AAJ中水的δ18O值圖1 FAJ和AAJ中水的δ18O值的特征Fig.1 Characteristic of δ18O in the water of FAJ and AAJ注：**表示AAJ與FAJ相比差異極顯著(P<0.05)(下同)

圖1-b是不同品種蘋果的鮮蘋果汁和100%摻假蘋果汁中水的δ18O值。

生命體征（體溫、心率、呼吸、血壓）及實驗室檢查（血常規、尿常規、肝腎功能及心電圖）的組間比較，差異均無統計學意義，實驗室相關的異轉率的組間比較，差異均無統計學意義。

由圖1可知，FAJ和AAJ之間的δ18O值存在明顯區別(P<0.05)，即摻假果汁的δ18O值均低于鮮榨果汁。FAJ中水的δ18O值在-4.54‰(JP)和-7.62‰(JG)之間，超過了西安當地水的δ18O值(-11.09‰)。此外，試驗所用不同品種蘋果的FAJ中水的δ18O值都高于歐洲(羅馬尼亞蘋果)果汁[18]。分析認為由于地理環境不同，影響了鮮榨蘋果汁的同位素比率[19]。圖1可以看出，隨著摻假程度的增高，δ18O值也依次降低，但AAJ的δ18O值隨摻假程度的變化規律需深入研究。

2.1.2 FAJ和AAJ中水的δD特征

外源水對δD值的影響見圖2。不同品種不同摻假程度蘋果汁中水的δD值變化見圖2-a，圖2-b是不同品種蘋果的FAJ和100% AAJ中水的δD值。

a-不同品種蘋果汁中水的δD值隨摻假程度的變化;b-不同品種FAJ和100% AAJ中水的δD值圖2 FAJ和AAJ中水的δD值的特征Fig.2 Characteristic of δD in the water of FAJ and AAJ

從圖2可知，所有FAJ中水的δD值均高于AAJ(P<0.05)，并且不同品種之間也存在差異。蘋果果實的δD通過蒸騰作用得以富集，其值高于地表水；但日照時間和降雨會影響不同蘋果品種的δD富集。由于氣候和地理環境的影響，不同品種蘋果的同位素值表現出一定的波動性，無法達到預期的效果。試驗得到的不同品種的δD值反映出FAJ和AAJ之間的一般特征，反映了果汁產品的“真實情況”，因為通常實驗室不是單從一個品種中獲取果汁來進行市場控制，而是以最終生成的果汁樣品進行分析。

由圖2可知，隨著摻假程度的不斷加深，δD值也發生變化。但是，大量AAJ樣品的δD值高于自來水(FAJ：-45.90‰～-59.00‰； AAJ：-50.70‰～-82.90‰；自來水：-65.52‰)，與預期結果不符。

分析檢測結果顯示δD值呈波動變化，所以用δ18O和δD值單一來判斷摻假程度存在一定難度，僅能判斷是否摻假，不能確定其摻假的量。所以需要在此基礎上對在不同摻假程度下δ18O與δD值的相關性進一步探討。

2.1.3 果汁中水的δ18O與δD值的相關性

盡管在不同時間和空間獲得的水的同位素組成有很大變化，但δD和δ18O之間呈規律性變化，并且通常呈線性相關。CRAIG等[20]首次發現北美大氣降水的δD和δ18O組成呈線性關系，根據這些實驗數據，CRAIG將大氣降水線性方程擬合為公式(3)，即著名的克雷格全球降水線(Graig′s meteoric water line, global meteoricwater line of Graig, GMWL)。

(3)

克雷格大氣降水方程使用標準平均海水作為世界上大多數地區的標準線，本試驗利用GMWL的特性來探討添加外源水的AAJ和FAJ中水的δD和δ18O關系，6組摻假果汁的分析結果如圖3所示。

圖3 不同品種蘋果汁中水的δD與δ18O的線性關系Fig.3 Linear relationship of δ18O and δD between different juice from different cultivars of apple注：圖例為FAJ比例

由圖3可知，AAJ(0%FAJ含量、20%FAJ含量、40%FAJ含量)的價值點高于GMWL(線性方程：y=8x+10)[21]。不同摻假比例的點均勻分布在摻假程度為100%和0%的回歸線之間，并顯示規律性，從圖3可知，摻假率分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%(FAJ)的AAJ具有統計學意義的氫氧同位素線性關系見表2。圖3說明摻假率不同的AAJ蘋果汁中水的δD和δ18O之間存在顯著相關性，且蘋果汁的δD和δ18O值均顯示出隨摻假程度的增加而降低的趨勢，當外源水的添加量最大(即100%AAJ)，δD和δ18O值達到最低值。這與BONTEMPO等[22]和OGRINC等[23]的發現相似，δD和δ18O值在基于IRMS的外來水摻假認證過程中起關鍵作用。

表2 不同果汁中水的δD與δ18O 值的方程擬合Table 2 Fitting of equations for δ18O and δD in FAJ

FAJ和100%AAJ的δD與δ18O 值分布范圍之間出現明顯的差異性(圖4)，進一步說明了FAJ、AAJ(即FC蘋果汁)的氫氧同位素δ18O和δD具有顯著區別，能夠有效鑒別FAJ、AAJ。這與鐘其頂等[8]對橙汁的NFC與FC果汁的研究結果相似。

圖4 不同品種蘋果FAJ與100%AAJ中水的δD與δ18O分布Fig.4 Distribution of δD and δ18O in water of FAJ and 100% AAJ from different apple cultivars

2.2 不同果汁中糖類δ13C值比較

2.2.1 實驗室自制FAJ中糖類的δ13C特征

通過HPLC-IRMS測定實驗室自制5個蘋果品種的FAJ中果糖、葡萄糖和二糖、寡糖的δ13C值，并通過面積歸一法計算各成分的含量，其典型的LC-IRMS圖譜如圖5所示，結果見表3。

A-果糖；B-葡萄糖；C-二糖；D-寡糖(下同) 圖5 鮮榨蘋果汁FAJ中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.5 LC-IRMS chromatogram of saccharides in FAJ

從圖5可知，在相應的保留時間671.37 s處(D)可以發現寡糖峰，而通過面積歸一化法計算的寡糖含量小于檢測限的0.7%。因此，認為未檢測到寡糖。表3顯示了FAJ中果糖，葡萄糖和二糖的δ13C值范圍(果糖-25.64‰～-26.83‰，葡萄糖-25.01‰～-26.36‰，二糖-22.41‰～-23.24‰)，此外，分別計算出了果糖、葡萄糖和二糖的百分比范圍為48.84%～52.39%，14.34%～28.85%，10.47%～18.78%。，這意味著一旦蘋果汁中的δ13C值和各成分的含量百分比不在這些范圍內，就可以認為存在摻假。

表3 FAJ中果糖，葡萄糖和二糖各組分的δ13C值和占總糖百分比Table 3 δ13 C value and percentage of the fructose, glucose and disaccharide in FAJ

2.2.2 實驗室制備的AAJ中糖類的δ13C特征

為了驗證2.2.1實驗數據的可靠性，使用LC-IRMS確定實驗室自制的AAJ中的δ13C值和各成分的百分比，LC-IRMS圖譜如圖6所示，結果見表4。

從圖6可知，寡糖的相應保留時間為670.42 s，但使用面積歸一化法計算出的寡糖含量也低于0.7%的檢出限，仍認為寡糖未被檢測到。

圖6 摻假蘋果汁中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.6 LC-IRMS chromatogram of saccharides in AAJ

表4 AAJ中果糖，葡萄糖和二糖各組分的δ13C值和占總糖百分比Table 4 δ13C value and percentage of the fructose, glucose and disaccharide in AAJ

注： AAJ-1，AAJ-2，AAJ-3分別代表摻假蘋果汁中的外源糖質量分數為0.1%、0.5%、2.5%

從表4可知，外源糖質量分數為0.1%、0.5%、2.5%的AAJ中二糖的δ13C的值(-15.94‰～-21.26‰)和外源糖含量僅2.5%的AAJ中二糖成分百分比(23.19%)不在FAJ的范圍內(表3)，這進一步證實了該方法的可靠性。

2.2.3 市售蘋果汁(CAJ)中糖類的δ13C特征

為判別上述結論的正確性，從超市購買了不同品牌的商業蘋果汁飲料，然后檢測分析其δ13C值和各成分的含量，結果見圖7和表5。從表5可以看出，CAJ-1樣品中的果糖、葡萄糖和二糖δ13C值分別為-19.95‰、-15.66‰和-14.59‰、不在FAJ的δ13C范圍內(表3)，在每種成分占總糖的百分比中，果糖僅為44.69%，葡萄糖為33.00%，綜上認為不符合FAJ的特性。該市售果汁樣品是AAJ。CAJ-2樣品的果糖和葡萄糖δ13C值分別為-26.12%、-25.34%,其結果在FAJ范圍內，可認為該樣品是純蘋果汁。

圖7 商業蘋果汁中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.7 LC-IRMS chromatogram of saccharides in commercial apple juice

所以LC-IRMS可以快速地區分真正的鮮榨蘋果汁，可作為一種簡單有效的方法來鑒定鮮榨蘋果汁[24]。

因為鮮榨蘋果汁和產糖作物(例如玉米和甘蔗)的δ13C值之差是由于“ C3”或“ C4”型的不同代謝引起的[20]。δ13C與摻假程度的相關性部分符合ROSSMANN等[25]提出的內部參考方法。試驗用LC-IRMS測定純鮮蘋果汁中果糖、葡萄糖和二糖的δ13C值，通過面積歸一化法計算各成分的百分比，然后通過實驗室用摻有白砂糖(C4型糖)的自制果汁進行驗證，發現摻假果汁數據與純果汁數據之間存在一定的差異。LC-IRMS可以大大提高蘋果汁的鑒偽檢測水平，但對于果汁中特定摻假糖漿的類型，尚無深入研究，這將是后續工作的重點。

表5 商業蘋果汁(CAJ)中糖類的δ13C值和占總糖質量百分比Table 5 δ13C value and percentage of sugar components in commercial apple juice (CAJ)

注：ND表示未檢出

3 結論

試驗研究表明，鮮榨蘋果汁中水的 δ18O 和 δD 值顯著高于摻假蘋果汁，摻假果汁中水的δD與δ18O值呈線性關系，且隨外源水含量增加而降低；鮮榨蘋果汁中糖分的δ13C值有比較確定的范圍和比例，且鮮榨與摻假蘋果汁的δ18O、 δD和法對所有大曲高光譜數據進行灰度共生矩陣參數δ13C值存在統計學差異。本研究所探討的δD，δ18O和δ13C同位素比鑒定鮮榨蘋果汁摻假程度的分析方法，克服了傳統鑒別方法不準確、操作復雜的問題，值得建立數據庫進行深入研究。