七葉皂苷對洛伐他汀在高脂血癥大鼠模型體內藥代動力學的影響

吳秀君，苑冬敏，陳克研，馬 然，韓 波，于 艷

0 引言

他汀類藥物是一類強效的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能夠顯著降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，是目前已知最有效的降脂藥物之一[1-2]。2016年國家心血管病中心發布的《中國成人血脂異常防治指南》明確了他汀類藥物作為血脂異常藥物治療的基石地位[3-4]。此外，他汀類藥物具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤生長并誘導腫瘤細胞凋亡[5-6]。盡管總體耐受性較好，但由于橫紋肌溶解以及肝腎功能損害等嚴重不良事件時有發生[7-8]，他汀類藥物的不良反應仍應引起足夠重視。研究顯示，他汀類藥物的不良反應發生率與藥物體內暴露水平有關，隨著暴露水平的增加可呈幾何倍數增加[9-10]。他汀類藥物主要經由藥物代謝酶CYP450代謝，CYP450的抑制或誘導可能改變他汀類藥物的代謝行為，導致藥物體內暴露水平增加或降低，從而造成不良反應增加或藥效降低[11-13]。

七葉皂苷是從七葉樹科植物天師栗的干燥種子中提取得到的一組三萜皂苷鹽，具有抗炎、抗滲出、消腫、增加靜脈張力及改善微循環等藥理作用，臨床上主要用于慢性靜脈功能不全、腦水腫、創傷和手術后引起的腫脹的治療[14-15]。近年來，大量研究證實，七葉皂苷具有明顯的抗腫瘤作用，使得這一中藥有了更廣泛的應用前景。除外用與口服劑型外，七葉皂苷主要通過靜脈滴注和靜脈注射給藥，在臨床上常與其他藥物配伍使用[16-17]。Huang等[18]研究顯示，七葉皂苷對大鼠肝CYP450有調控作用，能夠誘導CYP1A2的活性，但抑制CYP2C9和CYP3A4的活性。此外，七葉皂苷血漿蛋白結合率高，筆者前期研究顯示，七葉皂苷的血漿蛋白結合率高達95%[19]，這些特征均提示，七葉皂苷具有與其他合并用藥發生相互作用的潛力。

本研究以洛伐他汀為模型藥物，觀察高脂血癥大鼠中七葉皂苷對洛伐他汀藥代動力學行為的影響，旨在為他汀類藥物的臨床合理應用提供理論依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 API 4000型液相色譜質譜聯用儀，美國Applied Biosystem公司；TurboVap LV全自動濃縮儀，美國Zymark公司；Milli-Q Gradient A10超純水器，美國Millipore公司；LX全自動血液生化分析儀，美國Beckman公司；XS-225A電子分析天平，德國PRECISA公司。

1.2 藥品與試劑 洛伐他汀、洛伐他汀酸、辛伐他汀(內標，IS1)、辛伐他汀酸(內標，IS2)標準品購于中國藥品生物制品檢定所，洛伐他汀膠囊(哈藥集團制藥總廠)，注射用七葉皂苷鈉(武漢愛民制藥有限公司)，色譜純甲醇(美國Fisher公司)，其他試劑均為分析純。大鼠高脂飼料購于江蘇協同生物。

1.3 試驗動物 清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(180±10.0) g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 動物模型的建立 大鼠在標準環境[溫度(23±2) ℃，濕度(50%±10%)]中適應1周后，隨機分組，6只給予普通飼料，另外12只給予高脂飼料，5周后經眼眶靜脈采血測定三酰甘油(TG)、TC、LDC和高密度脂蛋白(HDL)。

2.1.2 分組與給藥 將造模成功的高脂血癥大鼠隨機分為2組，即單獨給藥組和聯合給藥組，每組6只大鼠。單獨給藥組大鼠尾靜脈注射給予0.9%生理鹽水，聯合給藥組大鼠尾靜脈注射給予注射用七葉皂苷鈉(0.5 mg/kg，以0.9%生理鹽水溶解)，1次/d，連續14 d。最后一次給藥后，兩組大鼠分別單劑量灌胃給予洛伐他汀(20 mg/kg，0.5%CMC-Na混懸液)，分別于洛伐他汀給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h于眼眶靜脈采血約0.3 ml，在2～8 ℃下5 000 r/min離心15 min，分離血漿，-70 ℃保存待測。

2.1.3 血清生化指標測定 血清生化指標采用全血自動生化分析儀測得。

2.1.4 血漿樣品中洛伐他汀和洛伐他汀酸濃度測定 色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Elipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-水(含10 mmol/L乙酸銨)(B)，梯度洗脫：0.0～1.3 min 80%～97%A，1.3～1.8 min 97% A，1.8～2.5 min 97%～80% A，2.5～3.7 min 80% A；流速為1.0 ml/min，1∶1分流；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI源)，多反應監測(MRM)模式；采用正負離子切換，洛伐他汀采用正離子檢測，電壓3 500 V，溫度 500 ℃。源內氣體1 (GS1，N2)壓力：45 psi；源內氣體2 (GS2，N2)壓力：35 psi。洛伐他汀酸采用負離子檢測，電壓-3 500 V，溫度500 ℃，GS1(N2)壓力：45 psi，GS2(N2)壓力：35 psi；洛伐他汀、洛伐他汀酸、辛伐他汀和辛伐他汀酸的解簇電壓(DP)分別為35、-55、50、-60 V，碰撞能量(CE)分別為35、-25、15、-25 eV，離子反應分別為m/z427.1、m/z325.3(洛伐他汀，正離子)，m/z421.4、m/z319.2(洛伐他汀酸，負離子)和m/z441.3、m/z325.1(IS1，正離子)，辛伐他汀酸(IS2，負離子)m/z435.4、m/z319.2。前2.6 min為負離子檢測，后1.1 min為正離子檢測。

生物樣品預處理：精密吸取100 μl大鼠血漿，精密加入10 μl內標溶液(50 ng/ml)，渦旋混勻后加入環己烷-二氯甲烷(3∶1) 3 ml，渦旋混勻30 s，振蕩10 min后，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液，置另一干凈玻璃試管中，50 ℃水浴N2吹干，殘渣用100 μl甲醇復溶后，12 000 r/min離心2 min，取上清10 μl進樣分析。

2.2 結果

2.2.1 血清生化指標 與食用普通飼料的大鼠相比，采用高脂飼料喂養5周后，SD大鼠血清TC、TG和LDL含量均顯著升高(P<0.01)，而HDL水平降低(P<0.05)，表明高脂血癥模型大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血清生化測定結果(mmol/L)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 方法學驗證 筆者對所建立的HPLC-MS/MS方法進行了方法學驗證，洛伐他汀和洛伐他汀酸在0.1～50 ng/ml濃度范圍內線性關系良好(R2>0.998 8)，最低定量限均為0.1 ng/ml。在低、中、高3個質控濃度水平(0.2、5、40 ng/ml)洛伐他汀和洛伐他汀酸的平均回收率(n=4)分別為80.2%～86.7%、78.5%～88.4%。洛伐他汀的日內和日間精密度(RSD，n=6)分別為2.3%～8.2%、1.4%～6.5%，洛伐他汀酸的日內和日間精密度(n=6)分別為1.1%～5.6%、2.5%～5.6%。洛伐他汀和洛伐他汀酸的準確度(RE，n=6)分別為0.2%～6.2%、1.1%～6.1%。大鼠血漿中，洛伐他汀和洛伐他汀酸的基質效應分別為98.7%～112.1%、86.8%～95.7%。該方法靈敏度高、精密度好，可用于大鼠血漿中洛伐他汀及其活性代謝物洛伐他汀酸的含量測定。

2.2.3 藥代動力學比較 大鼠口服洛伐他汀后，洛伐他汀和洛伐他汀酸的血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥代動力學參數見表2。結果顯示，在高脂血癥大鼠模型中，連續14 d給予七葉皂苷導致洛伐他汀代謝產物洛伐他汀酸的血漿暴露水平顯著升高，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別是單獨給藥組的2.43(90%CI：1.55，3.31)、2.66(90%CI：1.67，3.66)和2.99(90%CI：1.44，4.55)倍，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。聯合給藥后，洛伐他汀酸的血漿清除率(Clz)下降(P<0.01)，但兩組消除半衰期比較差異無統計學意義。聯合給藥后洛伐他汀的體內暴露水平也有所增加，但與單獨給藥組相比，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞差異均無統計學意義(P>0.05)，表明七葉皂苷對洛伐他汀的體內代謝沒有明顯影響。

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，人群飲食結構和生活方式的重大變化以及人口老齡化的加劇，高脂血癥的發生率呈逐年上升趨勢。2012年的調查結果顯示，中國成人血脂異?？傮w患病率高達40.40%，更為嚴峻的是青少年兒童高脂血癥患病率也有明顯增加[2]。高脂血癥已然成為危害身心健康的重要危險因素，對高脂血癥的防治已成為醫學界的一項重要課題，因此，尋求積極、有效的降脂治療方法具有重要的現實意義。目前，由于中醫藥的興起，中西醫結合治療正在成為降脂治療的新策略而被越來越多的用于臨床。然而，中西藥結合應用也增加了不良反應的風險，這已在大量的文獻中得到證實。

圖1 高脂血癥大鼠灌胃給予洛伐他汀后洛伐他汀及洛伐他汀酸的血藥濃度-時間曲線

表2 單獨給藥或與七葉皂苷聯合給藥后兩組大鼠洛伐他汀及其代謝物洛伐他汀酸的藥代動力學參數(n=6)

組別藥物AUC0-t(ng/ml·h)AUC0-∞(ng/ml·h)t1/2(h)Tmax(h)CLz[L/(h·kg)]Cmax(ng/ml)單獨給藥組洛伐他汀149.4±60.6185.5±86.410.4±8.14.1±3.81.6±0.812.2±7.9洛伐他汀酸133.2±48.1156.8±69.39.2±2.13.8±3.61.9±0.712.1±1.9聯合給藥組洛伐他汀181.7±98.2212.3±97.913.6±4.84.0±3.51.4±0.722.0±26.6洛伐他汀酸323.5±101.9*392.4±168.3*12.6±6.94.7±3.20.7±0.3**29.2±13.2*

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

洛伐他汀是第1代他汀類藥物，目前仍是臨床首選的調脂藥。其是一種內酯形式的無活性前體藥物，在體內62%轉化為開放酸活性代謝物，即洛伐他汀酸，38%轉化為閉環內酯代謝物。洛伐他汀酸是洛伐他汀的主要活性成分，其在體內主要經由CYP3A4/5代謝成無活性代謝產物而排出體外[13]。雖然洛伐他汀通常耐受性良好，但其具有肌病和橫紋肌溶解癥的嚴重不良反應，且發生頻率不定。研究表明，在藥物的全身暴露較高時，發生這些嚴重不良反應的風險顯著增加。因此，在洛伐他汀的臨床應用中，應考慮可能影響藥物暴露的因素，包括年齡、性別、身高、體重、種族、疾病狀態以及合并用藥等，其中，與合并藥物的相互作用(DDI)是必須考慮的重要因素之一。有報道，在他汀類藥物不良反應中，一半以上與DDI有關。由于洛伐他汀酸在體內主要經CYP3A4/5酶代謝，因此，CYP3A4/5酶抑制劑或誘導劑具有與洛伐他汀發生DDI的潛力。近年來，中藥對CYP450酶的抑制誘導作用的報道越來越多，由此導致的DDI也屢見不鮮。七葉皂苷作為一種中藥提取物，其對CYP3A4和CYP2C9酶的抑制作用已經得到證實[20]。七葉皂苷在臨床上常用于治療腦卒中所致的腦水腫，而他汀類藥物是腦卒中強化降脂治療的主要藥物，二者在聯合用藥時很有可能發生DDI。然而，迄今為止尚無七葉皂苷制劑與他汀類藥物相互作用的報道。本研究以洛伐他汀為模型進行研究，結果顯示，七葉皂苷降低了洛伐他汀在高脂血癥大鼠體內的代謝，導致其主要代謝產物洛伐他汀酸的暴露水平顯著增加，而對前體藥物洛伐他汀本身的體內暴露水平沒有顯著影響，推測七葉皂苷降低洛伐他汀酸代謝水平的機制可能與其對大鼠CYP3A4酶活性的抑制有關。

綜上所述，本研究初步證實，七葉皂苷可抑制洛伐他汀在高脂血癥大鼠體內的代謝，導致其暴露水平明顯增加，這種作用可能與七葉皂苷對藥物代謝酶CYP3A4的抑制有關。本研究結果提示，他汀類藥物在與七葉皂苷聯合應用時，應根據臨床情況合理調整劑量，減少或避免由于相互作用所造成的不良反應。