幾種魚蛋白肽體外結合膽酸鹽的效果研究

關計蘭，張樂云，肖 鶯，楊 萍

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088）

據統計，近年來高血脂的發生率明顯呈上升趨勢[1]，且主要集中在中老年人群中出現[2]，高血脂能夠引發很多嚴重影響人體健康的病癥，如動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，并且高血脂的并發癥有高血壓和糖尿病，對人體健康危害極大[3]，在高血脂的預防和治療方面都應引起重視，目前市面上流通的治療高血脂的化學類藥物因見效快而受到患者的青睞，但是這些藥物都會引起不同程度的副作用。近年來，具有輔助降血脂的功能性食品開發成為國內外最熱門的領域之一。目前，很多研究發現結合膽酸鹽的物質，可以將膽汁酸排出體外，促使膽固醇不斷轉化為膽汁酸，以維持膽汁酸池的動態平衡，從而降低血液中膽固醇的含量[4]，從而起到降血脂的作用。魚蛋白肽作為一種生物活性物質，可以由魚及其加工副產品酶解而得到，原材料種類眾多、資源充足。有關魚蛋白肽結合膽酸鹽效果的研究不多，江錕等人[5]發現，鱸魚蛋白酶解液在體外結合膽酸鹽的效果與酶解時間有關，酶解 5 h 時的酶解液的效果與處方降血脂藥物考來烯胺相當；朱曉連等人[6]發現，卵形鯧鲹魚肉胰蛋白酶解物對甘氨膽酸鈉體外結合率達到同濃度考來烯胺的48.3%。試驗比較了羅非魚肉肽、羅非魚皮肽、鰹魚肽的體外結合膽酸鹽的效果，以期為其進一步的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羅非魚肉肽A（羅非魚肉按照優化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后濃縮噴霧干燥而得到）、羅非魚皮肽B（羅非魚皮按照優化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后再經截留限為1 kU 超濾所得的截留液濃縮、噴霧干燥而得到）、羅非魚皮肽C（羅非魚皮按照優化的酶解工藝條件經酶解、離心、微濾后再經截留限為1 kU 的超濾所得的透過液濃縮、噴霧干燥而得到）、鰹魚肽D（去內臟的鰹魚按照優化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后再經截留限為300 U 的納濾得到的截留液濃縮、噴霧干燥而得到））、鰹魚肽E（去內臟的鰹魚按照優化的酶解工藝條件經酶解、離心、微濾后再經截留限為300 U 的納濾得到的透過液濃縮、噴霧干燥而得到），分別由實驗室制備；膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉，美國Sigma 公司提供；考來烯胺，南京厚生藥物有限公司提供；福林酚試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供；其他試劑均為分析純。

HHoS21-8-S 型數顯恒溫水浴鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司產品；UV757CRT 型紫外可見分光光度計，上海精科實業有限公司產品；FA1004 型精密電子分析天平，上海恒平科學儀器有限公司產品；Avanti J265 XP 型落地高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白質含量測定

采用福林酚法，標準曲線方程為Y=0.008X+0.005，R2=0.998。

1.2.2 膽酸鹽含量標準曲線的建立

參考張婷婷等人[7]的試驗并稍作修改。精密稱取干燥至恒質量的膽酸鹽標準品50 mg，置于50mL 容量瓶中，加入蒸餾水溶解，并加至刻度，搖勻。精密吸取25 mL，置于另一個50 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度處，搖勻備用。吸取0.5 mg/mL 的膽酸鹽標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于具塞試管中，加入蒸餾水至2.5 mL，再加入約51.5%的硫酸7.5 mL，置于70 ℃水浴中加入20 min，然后取出冰浴5 min，于波長387.5 nm 處測吸光度（A），以吸光度A 為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標，得到吸光度與膽酸鹽標準溶液濃度的線性方程，繪制標準曲線。得到3 種膽酸鹽的標準曲線：膽酸鈉的線性回歸方程為Y=15.00X+0.114，R2=0.999；甘氨膽酸鈉的線性回歸方程為Y=17.96X+0.081，R2=0.998；?；悄懰徕c的線性回歸方程為Y=13.83X+0.064，R2=0.999。

1.2.3 魚蛋白肽結合膽酸鹽能力的測定

準確稱取500 mg 的5 種不同魚蛋白肽和陽性對照考來烯胺置入錐形瓶，分別加入30 mL 質量濃度為0.2 mg/mL 的不同的膽酸鹽溶液，在37 ℃條件下水浴1 h，以蒸餾水為樣品空白，以膽酸鹽溶液為試劑空白。以轉速16 000 r/min 離心20 min，取上層清液，測定吸光度A，由標準曲線求得上清液中膽酸鹽的質量濃度，分別計算魚蛋白肽對膽酸鹽的結合率和結合量。

式中：A1——樣品空白的吸光度；

A2——樣品結合膽酸鹽后的吸光度；

A3——試劑空白的吸光度；

V——膽酸鹽溶液/蒸餾水體積，mL；

M——樣品質量，mg。

1.2.4 模擬胃腸道環境對魚蛋白肽結合膽酸鹽能力的影響

參考朱曉連等人[6]的試驗并稍作修改。取質量濃度600 mg/mL 的羅非魚肉肽溶液2 mL 于25 mL 具塞試管中。加入2 mL HCl（濃度為0.01 mol/L），在37 ℃水浴中恒溫振蕩1 h（模擬胃環境）。隨后加入NaOH溶液（濃度為0.1 mol/L）調節pH 值至6.3。再加入10 mL 豬胰酶溶液（質量濃度為10 mg/mL 的模擬腸環境）和8 mL 配置好的膽酸鹽溶液（質量濃度為0.3 mg/mL），在37 ℃水浴下恒溫振蕩1 h。以磷酸鹽緩沖液作為樣品空白，以膽酸鹽溶液為試劑空白。將恒溫振蕩后的樣品轉入離心管，以轉速16 000 r/min 離心20 min。取上清液2.5 mL 于25 mL具塞試管中，加入硫酸7.5 mL，于70 ℃條件下水浴20 min。冰浴5 min 冷卻后，于波長387.5 nm 處測定吸光度，由標準曲線求得上清液中膽酸鹽的濃度，分別計算結合率和結合量。

2 結果和分析

2.1 5種魚蛋白肽的可溶性蛋白質含量

5 種魚蛋白肽的可溶性蛋白含量見表1。

表1 5 種魚蛋白肽的可溶性蛋白含量 / mg·g-1

由表1 可見，羅非魚皮肽C（<1 kU）的可溶性蛋白含量最高，羅非魚肉肽A、羅非魚皮肽B（>1 kU），鰹魚肽D（>300 U）、鰹魚肽E（<300 U）可溶性蛋白含量相仿且較低?？扇苄缘鞍踪|含量的高低與肽的水解度有關。

2.2 5種魚蛋白肽對3 種膽酸鹽的結合效果

5 種魚蛋白肽對膽酸鹽結合率和結合量的影響見表2。

由表2 可知，羅非魚肉肽A 對3 種膽酸鹽都有一定的結合能力，對?；悄懰徕c的結合率和結合量最高為38.27%和1.32 mg/g，其次是對甘氨膽酸鈉的為34.07%和1.04 mg/g，對膽酸鈉的最低為20.80%和0.82 mg/g；而羅非魚皮肽B（>1 kU）對3 種膽酸鹽都沒有結合效果；羅非魚皮肽C（<1 kU）對?；悄懰徕c有微弱的結合效果，結合率和結合量只有0.82%和0.03 mg/g；鰹魚肽D（>300 U）對3 種膽酸鹽都沒有結合效果；鰹魚肽E（<300 U）對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉都有結合效果，結合率和結合量分別為21.52%和0.74 mg/g，7.25%和0.22 mg/g?？傮w來說，沒有經過分級分離的羅非魚肉肽、分子量較小的組分鰹魚肽E<300 U和羅非魚皮肽C<1 kU 具有一定的結合膽酸鹽能力，其中以羅非魚肉肽的效果最好。而考來烯胺對3 種膽酸鹽都有較高的結合率和結合量，對膽酸鈉的可達93.10%和3.67 mg/g，對?；悄懰徕c達97.18%和3.36 mg/g，對甘氨膽酸鈉達94.73%和2.88 mg/g。比較可知，羅非魚肉肽結合?；悄懰徕c的能力約為考來烯胺的40%。據報道?；悄懰徕c是屬于較難被結合的結合型膽酸鹽，容易結合?；悄懰徕c的物質，對其他膽酸鹽也有結合能力。因此，選擇羅非魚肉肽進一步研究。

表2 5 種魚蛋白肽對膽酸鹽結合率和結合量的影響

2.3 羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結合的影響

羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結合率和結合量的影響見表3。

表3 羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結合率和結合量的影響

由表3 可知，從結合率看，羅非魚肉肽對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合能力均隨用量增加而增加的。從結合量看，羅非魚肉肽的添加量在超過500 mg 之后，對3 種膽酸鹽的結合能力都下降，所以無論是從結合率還是結合量來看，羅非魚肉肽用量在450～500 mg，即15.0～16.7 mg/mL 時，較為適宜。

2.4 模擬胃腸道環境對羅非魚肉肽結合膽酸鹽的影響

模擬胃腸道環境對羅非魚肉肽結合膽酸鹽結合率和結合量的影響見表4。

表4 模擬胃腸道環境對羅非魚肉肽結合膽酸鹽結合率和結合量的影響

由表4 可知，在模擬經過人體的胃部消化、再到pH 值為6.3 小腸后，羅非魚肉肽對3 種膽酸鹽都有結合能力，但是與沒有模擬胃腸道環境的結果相比，羅非魚肉肽對膽酸鈉的結合能力明顯下降，結合率和結合量僅為2.46%和0.10 mg/g，而對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合率和結合量分別為43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，對比表3 可知，此時羅非魚肉肽對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合能力都提高了。

2.5 時間對羅非魚肉肽結合膽酸鈉的影響

時間對羅非魚肉肽結合膽酸鈉結合率和結合量的影響見表5。

表5 時間對羅非魚肉肽結合膽酸鈉結合率和結合量的影響

由表5 可知，羅非魚肉肽對膽酸鈉的結合率和結合量隨著時間的延長而增大，60 min 基本達到平衡，80 min 最大為31.15%和1.06 mg/g，而考來烯胺能夠迅速結合膽酸鈉，20 min 時結合率和結合量可達98.12%和3.45 mg/g，且基本達到平衡。

3 結論

通過研究羅非魚肉肽、羅非魚皮肽B（>1 kU）、羅非魚皮肽C（<1 kU）、鰹魚肽D（>300 U）、鰹魚肽E（<300 U）5 種魚蛋白肽對膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結合能力，發現羅非魚皮肽B、鰹魚肽D 對3 種膽酸鹽都沒有結合能力，羅非魚皮肽C對?；悄懰徕c、鰹魚肽E 對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉有較弱的結合能力，而羅非魚肉肽對3 種膽酸鹽都有一定的結合能力，其對?；悄懰徕c的結合率和結合量最高為38.27%和1.32 mg/g，對甘氨膽酸鈉的為34.07%和1.04 mg/g，對膽酸鈉的最低為20.80%和0.82 mg/g；羅非魚肉肽添加量為15.0～16.7 mg/mL時，結合膽酸鹽的能力較為適宜，模擬胃腸道環境實驗中發現羅非魚肉肽對?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉的結合率和結合量都提高，分別達到43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，對膽酸鈉的結合率和結合量降低為2.46%和0.10 mg/g，羅非魚肉肽在20 min 對膽酸鈉結合率和結合量可達12.93%和0.33 mg/g，60 min 基本達到平衡為28.74%和0.96 mg/g。陽性對照考來烯胺對3 種膽酸鹽都有較高的結合率和結合量，對膽酸鈉的可達93.10%和3.67mg/g，對?；悄懰徕c的達97.18%和3.36 mg/g，對甘氨膽酸鈉的達94.73%和2.88 mg/g。羅非魚肉肽結合?；悄懰徕c的能力約為考來烯胺的40%。結合5 種肽的可溶性蛋白含量可知，水解度會影響魚蛋白肽結合膽酸鹽的能力，但是蛋白種類是更為重要的影響因素，所以進一步開展對羅非魚肉肽的分級純化及理化性質的研究很有必要。