水相酶解法提取柚籽油的研究

武 玲，胡愛軍，陳 文，鄭 捷

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.春金（天津）油脂有限公司，天津 300452）

柚子（Citrus paradisi Macf.），又稱文旦、香欒等[1]，是蕓香科柑橘屬植物，喜歡在溫暖潮濕的地方生長，在我國福建、江西、廣東、廣西等南方地區均有大面積栽培[2]。柚籽是柚子加工或食用的副產物，目前還未得到有效利用，常作為廢物丟棄，不僅導致可利用資源的浪費，而且會產生環境污染[3]。柚籽中油脂含量豐富，可達到40 %以上，且富含不飽和脂肪酸[4]，具有增強免疫力、保護心腦血管、提高記憶力、降低血壓和血脂的作用[5]，可以作為油料資源進行開發。柚籽油是金黃色的透明液體，在室溫下有良好的流動性。

傳統的油脂提取方法有壓榨法和有機溶劑萃取法[6]，這2 種方法也是工業化生產中油脂的主要提取方法，但是這2 種方法均有其局限性，有機溶劑萃取法會產生溶劑殘留，壓榨法的出油率低，油脂易氧化，會導致油脂質量下降[7]。隨著油脂工業的發展，人們又研究出了水相酶解法、超聲波萃取法、超臨界CO2萃取法、亞臨界流體萃取法等新的提取工藝[8-11]。

水相酶解法是在機械破碎的基礎上，利用各種生物酶降解植物細胞壁或溶解細胞中的可溶性物質，同時減少乳狀液生成和對已經生成的乳狀液進行破乳，使油料得以釋放，再利用水油不相容的原理和離心分離的方法將油脂提取出來[12]。水相酶解法具有高效、環保、無殘留的特點，發展前景良好[13]。以副產物柚籽為原料，應用水相酶解法提取柚籽油，以提取率作為評價指標，考查酶種類、料液比、酶解溫度、酶解時間及酶解pH 值對柚籽油提取效果的影響，通過正交試驗得到水相酶解法提取柚籽油的最佳工藝條件，以期為柚籽油的提取和柚籽的開發利用提供技術支撐和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

柚子籽；中性蛋白酶（10 萬U/g）、堿性蛋白酶（10 萬U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；復合果膠酶（果膠酶+纖維素酶，1∶1；10 萬U/g），浙江嘉合生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

CS-700 型高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工貿有限公司產品；FA2204B 型電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司產品；SHZ-82A 型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司產品；BIOS 16 型大容量臺式離心機，賽默飛世爾科技公司產品；DL-106型電熱鼓風干燥箱，天津市中環實驗電爐有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 水相酶解法提取柚籽油工藝流程

1.3.2 水相酶解法提取柚籽油操作要點

將柚籽粉碎、烘干，稱取一定質量柚籽粉，加入適量的蒸餾水攪均成漿，在沸水浴中滅酶1 h。冷卻后向勻漿中加入適量酶，將其放入恒溫水浴中進行酶解反應（以轉速120 r/min 攪拌）。酶解結束后，進行第1 次離心（以轉速4 000 r/min 離心10 min），分離出乳化層進行破乳，然后第2 次離心（以轉速4 000 r/min 離心10 min），將2 次離心得到的游離油置于干燥箱中，在105 ℃條件下烘干至恒質量，稱得其質量。柚籽油提取率的計算公式為：

1.3.3 酶種類對提取率的影響

稱取適量柚籽粉，料液比1∶5（g∶mL），調節pH 值，加入定量酶，于50 ℃的恒溫搖床中進行酶解反應（以轉速120 r/min 攪拌），酶解時間3 h。分別比較堿性蛋白酶（1%，pH 值10.0）、中性蛋白酶（1%，pH 值 7.0）、復合果膠酶 （1%，pH 值 4.0）、堿性蛋白酶+復合果膠酶（0.5%+0.5%，pH 值6.0）、中性蛋白酶+復合果膠酶（0.5%+0.5%，pH 值5.0）作用下的提取率，選擇出提取柚籽油的最適單酶或多酶。

1.3.4 料液比對提取率的影響

稱取適量柚籽粉，加入蒸餾水，調節pH 值至6.0，加入堿性蛋白酶（0.5%）+復合果膠酶（0.5%），于50 ℃恒溫搖床中進行酶解反應（以轉速120 r/min攪拌），酶解時間3 h。研究料液比分別為1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8 時柚籽油的提取率，選擇出提取柚籽油的最適料液比。

1.3.5 酶解時間對提取率的影響

稱取適量柚籽粉，料液比1∶5，調節pH 值至6.0，加入堿性蛋白酶 （0.5%）+ 復合果膠酶（0.5%），于50 ℃的恒溫搖床中進行酶解反應（以轉速120 r/min 攪拌）。研究酶解時間分別為1，2，3，4，5 h 時柚籽油的提取率，選擇出提取柚籽油的最適酶解時間。

1.3.6 酶解溫度對提取率的影響

稱取適量柚籽粉，料液比1∶5，調節pH 值至6.0，加入堿性蛋白酶 （0.5%）+ 復合果膠酶（0.5%），調節恒溫搖床溫度，達到溫度后放入原料進行酶解反應（以轉速120 r/min 攪拌），酶解時間3 h。研究酶解溫度分別為30，40，50，60，70 ℃時柚籽油的提取率，選擇出提取柚籽油的最適酶解溫度。

1.3.7 酶解pH 值對提取率的影響

稱取適量柚籽粉，料液比1∶5，調節pH 值，加入堿性蛋白酶（0.5%）+復合果膠酶（0.5%），在50 ℃恒溫搖床中進行酶解反應（以轉速120 r/min 攪拌），酶解時間3 h。研究酶解pH 值分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 時柚籽油的提取率，選擇出提取柚籽油的最適酶解pH 值。

1.3.8 最佳提取工藝條件的確定

根據單因素試驗結果，以酶解pH 值、酶解溫度、酶解時間為參考因素，以柚籽油提取率為指標，設計L9（34）正交試驗以優化提取工藝。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 酶種類對提取效果的影響

酶種類對柚籽油提取率的影響見圖1。

由圖1 可知，堿性蛋白酶+復合果膠酶的提取效果最好，而復合果膠酶的提取效果最差。其可能是因為柚籽細胞壁的主要成分為果膠、纖維素等[14]，當單獨使用復合果膠酶時，雖然細胞壁被降解，但柚籽細胞組織內的油脂還在以脂蛋白、脂多糖等復合體的形式存在[15]，油脂的流動性較差，因此復合果膠酶的提取效果最差；只添加蛋白酶時，柚籽的細胞壁被破壞程度小，油脂不易從細胞內釋放出來，因此只添加蛋白酶時提取效果也不理想；同時添加蛋白酶和果膠酶時，可以使油脂順利釋放出來。綜上，選用堿性蛋白酶和復合果膠酶進行柚籽油的提取效果最好。

圖1 酶種類對柚籽油提取率的影響

2.2 料液比對提取效果的影響

料液比對柚籽油提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對柚籽油提取率的影響

料液比是通過影響底物與酶的接觸面積而影響柚籽油的提取率。由圖2 可知，當料液比為1∶4時，水的添加量少，體系的黏度大，柚籽粉與酶的流動性差，酶的作用效果低，不利于反應的持續發生，因而提取率較低。隨著水的添加量增多，有利于柚籽粉與酶充分接觸，柚籽粉與酶之間的接觸面積增大，傳質速率提高，從而使提取率升高。當料液比減小至1∶5 時，柚籽油的提取率達到最大。當添加的水過量時，反應體系中底物濃度和酶濃度都降低，底物與酶的撞擊機率降低，柚籽粉與酶之間的接觸面積減小，酶的作用效果降低，提取率逐漸下降。因此，試驗提取率最高時的料液比為1∶5。

2.3 酶解時間對提取效果的影響

酶解時間對柚籽油提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，在酶解初期，提取率會隨時間的增加而快速提高，在3 h 時達到峰值，然后處于相對穩定的狀態，當反應時間繼續延長時，提取率不會再大幅度提高，甚至有所下降。其可能的原因是，在前一階段底物充足，細胞壁的結構隨著時間的延長在酶的作用下會逐漸變得疏松，酶的作用點數也會增加，酶解越來越充分，從而使油的釋放量增加；當達到一定時間后，細胞壁結構基本疏散完全，酶解也基本達到平衡；當酶解時間過長時，底物減少，不會再釋放出更多的油脂，同時還會使油脂的品質下降[16]。因此，柚籽油提取的最適酶解時間為3 h。

圖3 酶解時間對柚籽油提取率的影響

2.4 酶解溫度對提取效果的影響

酶解溫度對柚籽油提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對柚籽油提取率的影響

酶解溫度影響酶的活性，從而影響柚籽油的提取率。由圖4 可知，在酶解溫度達到50 ℃之前，提取率隨溫度的升高而增大；在50 ℃時，提取率達到最大；當溫度高于50 ℃時，提取率隨溫度的升高而降低。這是由于在一定的溫度范圍內，酶的活性隨著溫度的升高而增強，提取率就會隨之升高。酶的化學本質為蛋白質，當溫度過高時，蛋白質間的分子作用力會被破壞，其高級結構也隨之被打破，而酶對于底物的催化活性高度依賴于蛋白質的高級結構，酶的活性降低甚至失活，柚籽油的提取率也隨之下降。上述研究結果表明，提取柚籽油的最適酶解溫度為50 ℃。

2.5 酶解pH 值對提取效果的影響

酶解pH 值對柚籽油提取率的影響見圖5。

由圖5 可知，酶的活性受到反應環境的pH 值影響，pH 值過低或過高都會使酶的活性降低，從而影響柚籽油的提取率。pH 值過小時，酶的必需基團離子化，酶與底物結合的能力下降，因而酶的活性被抑制，提取率較低；pH 值過大時，過堿的環境會破壞穩定酶三維結構的非共價鍵，使酶蛋白變性，酶的活性降低，柚籽油的提取率隨之減小。因此，在堿性蛋白酶與復合果膠酶混合使用時的最適pH 值為5.0。

圖5 酶解pH 值對柚籽油提取率的影響

2.6 水相酶解法提取柚籽油工藝優化

根據單因素試驗的結果，發現酶解pH 值、酶解溫度和酶解時間是影響柚籽油提取率的主要因素，因此采用L9（34）正交試驗，進行水相酶解法提取柚籽油工藝優化。

正交試驗結果見表2，正交試驗方差分析見表3。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

極差越大，對柚籽油提取率的影響越大，因此由表2 可知，3 個因素對柚籽油提取率的影響大小為酶解溫度>酶解時間>酶解pH 值。由表3 可知，酶解溫度和酶解時間為顯著因素。由表2 可知，當料液比為1∶5，使用堿性蛋白酶+復合果膠酶時，水相酶解結合溶劑萃取法提取柚籽油的最適提取參數為A2B2C3，即酶解pH 值為5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h。根據正交試驗得到的優化工藝條件，進行3 組平行驗證試驗得到柚籽油的平均提取率為76.08%。

3 結論

通過單因素試驗，水相酶解法提取柚籽油的適宜用酶為堿性蛋白酶與復合果膠酶的混合酶，最佳料液比為1∶5，通過正交試驗優化后的工藝參數為酶解pH 值5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h，此條件下進行柚籽油提取的3 次驗證試驗表明柚籽油平均提取率為76.08%。各因素對柚籽油提取率的影響大小依次為酶解溫度>酶解時間>酶解pH 值，酶解溫度和酶解時間為顯著因素。研究有必要進行放大試驗，為水相酶解法提取柚籽油技術的產業化應用奠定基礎。