超聲波協同復合酶提取猴頭菇多糖的研究

傅 奇，肖玉娟，毛玉婷，林慧霞，周小偉

（1.廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建廈門 361024；2.江西省山江湖開發治理委員會辦公室，江西南昌 330046；3.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東韶關 512005）

0 引言

猴頭菇又名猴頭菌、刺猬菌[1]，蛋白質、維生素和礦物質等含量豐富，且含有人體必需的8 種氨基酸，干猴頭菇所含有的蛋白質含量為香菇的2 倍[2]。作為猴頭菇的主要活性成分，猴頭菇多糖具有極高的營養價值，具有保肝護肝、增強機體免疫力、抗腫瘤、降血糖和降血脂等[3-4]生理功能。猴頭菇多糖主要是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等重要成分構成的葡聚糖，是β-1,3 鍵連接的主鏈和β-1,6 鍵連接的支鏈構成的基本結構[5]。

迄今為止，水提法、超聲波技術和酶法技術[6-10]已廣泛應用于植物多糖的提取中。同時，多種提取方法的協同作用對于提高多糖的提取率也大有裨益。如超聲微波協同提取富硒蛹蟲草硒多糖[11]，超聲-酶法[12-14]提取百合多糖、玉米多糖、杏鮑菇多糖等。近年來，研究人員主要通過熱水浸提法、酶法、微波提取法、超聲波提取法、微波協同復合酶法等提取猴頭菇多糖[15]。但傳統熱水浸提法耗時長且提取率較低，而超聲波由于其強烈的空化和攪拌作用等可以有效加速植物中的多糖溶于溶劑中[16]，從而縮短提取時間，同時該提取方法溫度低，能夠防止多糖的結構被長時間的高溫作用毀壞，得以大大提高多糖的提取率。同時，酶制劑由于安全、高效，被廣泛應用于食用菌的功能活性物質提取。

試驗對比超聲波協同復合酶提取猴頭菇多糖得率和超聲波法提取猴頭菇多糖得率情況，并通過正交試驗優化出超聲波協同復合酶法提取猴頭菇多糖的最優工藝條件，以期提高多糖的提取率，增大猴頭菇的利用率，提高猴頭菇產品的營養價值。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

干猴頭菇，五馬寨菌業有限公司提供；纖維素酶（15 000 U/g）、果膠酶（15 000 U/g），均為食品級；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6 新世紀型可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；CS-2000 型高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工貿有限公司產品；HH-S16s型數顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠產品；SK8210LHC 型超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司產品；ZD-2 型自動電位滴定儀，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；DHG-9076 型電熱恒溫鼓風干燥箱，江蘇金壇市大地自動化儀器廠產品；SHD-Ⅲ型循環水式多用真空泵，保定高新區陽光科教儀器廠產品；BS210S 型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產品；YP1201N 型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

干猴頭菇→粉碎→過30 目篩→稱重→溶解→復合酶酶解→超聲波處理→滅酶→抽濾→除蛋白→醇沉→冷凍干燥→猴頭菇粗多糖→測定。

2.2 多糖含量的測定——苯酚硫酸法[17]

稱取適量粗多糖溶于水，配成供試液，按標準曲線制備方法測定吸光度，代入標準曲線，計算多糖含量，并計算猴頭菇多糖提取率。

2.2.1 標準曲線建立

0.50 g 葡萄糖在80 ℃下干燥至恒質量，稱取0.01 g 葡萄糖標準品溶解，在100 mL 容量瓶中定容，振蕩搖勻，配成質量濃度0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。

稱取5 g 苯酚，添加適量蒸餾水并攪拌，待其完全溶解后，定容至100 mL。

分別移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的葡萄糖標準液于試管中，依次添加1 mL 質量分數5%的苯酚溶液，振蕩，再緩慢加入5 mL 的濃硫酸，邊添加邊振蕩。蒸餾水作為空白對照。20 min 后，于波長490 nm 處測定樣液。

2.2.2 多糖含量計算[18]

多糖含量根據式（1）計算

式中：C——樣品溶液葡萄糖質量濃度，mg/mL；

V——供試液體積，mL；

m——供測粗多糖質量，mg。

2.2.3 多糖提取率計算[18]

多糖提取率按式（2）計算

式中：m——醇沉后得到的粗多糖總質量，g；

m1——稱取的猴頭菇樣品干質量，g。

2.3 猴頭菇粗多糖的提取方法

2.3.1 超聲波提取法

稱量5 g 猴頭菇粉，根據料液比添加適量的蒸餾水，攪拌溶解，并選用超聲功率、超聲時間、料液比作為試驗因素，各取5 個水平進行單因素試驗，超聲功率200，250，300，350，400 W；超聲時間5，10，15，20，25 min；料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30。以單因素試驗結果為依據總結各因素的最佳條件，并通過三因素三水平正交試驗進一步研究因素間的相互影響，根據正交試驗得到超聲波提取猴頭菇多糖的最優組合。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2.3.2 超聲波協同復合酶提取法

（1）單因素試驗。稱量5 g 猴頭菇粉，根據料液比添加適量的蒸餾水，攪拌溶解，在復合酶比例為1∶1，酶解時間30 min，pH 值4，酶解溫度50 ℃的條件下完成復合酶酶解，選取超聲時間、超聲功率、料液比、復合酶添加量作為因素，各選取5 個水平進行單因素試驗，確定各因素最優水平。

①超聲時間對多糖提取率的影響。在超聲功率250 W，料液比1∶25，復合酶添加量2%的基礎上，采用10，15，20，25，30 min 的超聲時間進行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的超聲時間產生的變化。②超聲功率對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，料液比1∶25，復合酶添加量2%的基礎上，采用200，250，300，350，400 W 的超聲功率進行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的超聲功率產生的變化。③料液比對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，超聲功率250 W，復合酶添加量2%的基礎上，采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35 的料液比進行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的料液比產生的變化。④復合酶添加量對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，超聲功率250 W，料液比1∶25 的基礎上，采用1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的復合酶添加量進行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的復合酶添加量產生的變化。

（2）正交試驗。依據單因素試驗的分析結果，分別選取超聲時間、超聲功率、料液比、復合酶添加量4 個因素，按照四因素三水平表完成正交試驗，因素之間的交互作用將不被予以考慮。并通過正交試驗總結出最高的多糖提取率組合。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

3 結果與分析

3.1 標準曲線繪制

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

由圖1 可知，回歸方程 Y=8.802 9X+0.009 5，R2=0.998 8，線性關系良好。

3.2 超聲波提取法

3.2.1 單因素試驗結果

（1）超聲時間的影響。

不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖2。

由圖2 可知，多糖提取率在時間逐漸增加的情況下先升高后降低，當超聲時間為5～15 min 時，多糖提取率顯著升高；在超聲處理15 min 后，多糖提取率緩慢降低，這是由于超聲波具有高的加速度，使有效成分快速被提取出來，多糖的提取率升高，當達到一定時間后，猴頭菇提取液體系滲透壓達到平衡，多糖得率也就趨于平穩。超聲時間太長會破壞局部多糖的結構，使多糖含量減少，提取率降低，同時也造成能源浪費。通過分析可知，最佳超聲時間為15 min，并選擇超聲時間10，15，20 min 進行正交試驗。

圖2 不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響

（2）超聲功率的影響。

不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著超聲功率的增大先迅速提高后平緩降低，多糖提取率在超聲功率為200～300 W 逐漸提高；當功率超過300 W 時，多糖提取率緩慢降低，這可能是因為超聲功率逐漸提高，對細胞壁的破損程度逐漸增大，使多糖快速溶出，提取率升高，但超聲功率太大可能造成反應容器內部部分溫度急速升高，破壞猴頭菇多糖的結構，使多糖提取率下降。通過以上分析可知，超聲功率選擇300 W 為宜，并選取超聲功率250，300，350 W進行正交試驗。

（3）料液比的影響。

不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，多糖提取率因溶劑量逐漸增加先升高后降低，多糖提取率在料液比1∶10～1∶15 迅速提高；但在料液比1∶15 之后逐漸降低。這是由于多糖溶解已達到基本飽和，但繼續添加溶劑會使多糖濃度降低，同時也造成能源浪費。通過以上分析可知，料液比選1∶15 為宜，并選擇料液比1∶10，1∶15，1∶20 進行正交試驗。

3.2.2 正交試驗結果

圖4 不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

采用L9（34）的正交水平表完成正交試驗。

L9（34）正交試驗結果與分析見表3。

表3 L9（34）正交試驗結果與分析

由表4 可知，各個因素水平都影響猴頭菇多糖的提取率，通過比較極差R 值可知，影響多糖提取率的主要次序為料液比>超聲功率>超聲時間，同時表明猴頭菇多糖提取率受料液比的影響最大，并得出超聲波提取猴頭菇多糖的最優方案組合為A2B2C3，即超聲時間15 min，料液比1∶20，超聲功率300 W，多糖提取率達到了最高為16.96%。

3.3 超聲波協同復合酶提取多糖

3.3.1 單因素試驗結果

（1）超聲時間的影響。

不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖5。

圖5 不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖5 可知，多糖提取率在時間逐漸延長的情況下，先升高后降低。當超聲處理為10～20 min 時，多糖提取率顯著升高；在超聲處理20 min 后，多糖提取率緩慢上升；當超聲時間大于25 min 時，多糖提取率逐漸降低，推測可能因為超聲波不僅具有高的加速度，還存在劇烈的空化效應、攪拌影響等，使有效成分快速流入溶液，多糖的提取率升高，但超聲時間太長會破壞局部多糖的結構，使多糖含量減少，提取率降低。通過分析可知，最佳超聲時間為25 min，并選擇超聲波提取時間20，25，30 min進行正交試驗。

（2）超聲功率的影響。

不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響見圖6。

圖6 不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖6 可知，多糖提取率因為超聲功率逐漸增大先緩慢升高后降低，多糖提取率在超聲功率為200～350 W 逐漸提高，當超聲功率大于350 W 時多糖提取率顯著降低，這可能是因為超聲功率逐漸增大，對細胞壁的破損程度逐漸提高，使多糖快速溶出，有利于多糖提取率的提高，也可能是超聲功率產生的空化效應在一定程度上增強了復合酶的活力，促進酶法提取過程的進行，提高了多糖提取率，但超聲功率太大可能造成反應容器內部部分溫度急速升高，在短時間內破壞猴頭菇多糖的結構，增加細胞膜和細胞壁通透性，使多糖提取率下降[19]。通過以上分析可知，超聲功率選350 W 為宜，并選擇超聲功率300，350，400 W 進行正交試驗。

（3）料液比的影響。

不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響見圖7。

由圖7 可知，在溶劑量逐漸增大的條件下，多糖提取率先升高后降低，多糖提取率在料液比1∶15～1∶30 逐漸增大，但在料液比1∶30 之后多糖提取率降低。由此說明，料液比為1∶30 時可以充分提取多糖，此時多糖得率較高，但過高的料液比會對提取液的濃縮產生影響，從而使多糖得率降低，同時也造成能源浪費。通過以上分析可知，料液比選1∶30 為宜，并且選擇料液比 1∶25，1∶30，1∶35 進行正交試驗。

圖7 不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

（4）復合酶添加量的影響。

不同復合酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響見圖8。

圖8 不同復合酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖8 可知，多糖提取率在復合酶添加量逐漸增加的情況下先提高后降低，多糖提取率在復合酶添加量1%～2%時逐漸增大，但在酶添加量2%之后多糖提取率逐步降低，在一定條件下，酶添加量越高，酶解效果越強，但復合酶的添加量不能過高，高酶量作用太過強烈會破壞多糖結構，使多糖提取率降低，通過以上分析可知，復合酶添加量應選以猴頭菇粉的2%為宜，并且選擇復合酶添加量1.5%，2.0%，2.5%進行正交試驗。

3.3.2 正交試驗結果分析

采用L9（34）的正交水平表完成正交試驗。

L9（34）正交試驗結果與分析見表4。

由表4 可知，各因素水平對猴頭菇多糖的提取率存在相應的影響，通過比較極差R' 值可知，影響猴頭菇多糖提取率的主要次序為超聲功率>料液比>超聲時間>復合酶添加量，說明影響多糖提取率最大的因素是超聲功率，從而得出超聲波協同復合酶提取猴頭菇多糖的最優方案組合為A'2B'2C'1D'3，即超聲時間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，復合酶添加量2.5%，在此條件下多糖提取率達到了最高為19.44%。

4 結論

通過單因素試驗和正交試驗，得出在猴頭菇粗多糖的提取中，超聲波協同復合酶提取方法的最優工藝條件為超聲時間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，復合酶添加量2.5%，此條件下猴頭菇多糖提取率達到最高值19.44%。

表4 L9（34）正交試驗結果與分析