GC-MS/MS法測定蔬菜中苯醚甲環唑殘留量的不確定度評定

譚錦萍，阮 征，陳羽中，黃小清

（1.華南理工大學，廣東廣州 510000；2.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 510410）

苯醚甲環唑又名噁醚唑，是一種具有高效、廣譜、低毒和內吸傳導性強的三唑類殺菌劑，對作物具有保護和治療作用，廣泛應用于水果和蔬菜等農作物上[1]。通過抑制麥角甾醇的生物合成、破壞細胞膜結構功能，從而達到殺菌目的，對蔬菜和瓜果的紋枯病、銹病、早疫病、葉斑病、黑星病、白粉病等具有較好的保護和治療作用。由于苯醚甲環唑具有持效期長、與其他殺菌劑無交互抗性、不污染農產品、不殺傷天敵的優點[2-3]，加上農民合理使用農藥的水平有限、誤用和濫用情況嚴重，容易造成一些病蟲害對其產生耐藥性。在農產品的日常監督抽檢中發現，265個蔬菜樣品中檢出苯醚甲環唑的陽性樣品有50個，檢出率高達18.87%?？梢?，苯醚甲環唑在蔬菜種植中比較常用。

標準[4]規定，某些蔬菜苯醚甲環唑的最高殘留限量 （Maximum residue limit，MRL） 為 0.2 mg/kg。在實際檢測中，當苯醚甲環唑的檢出值在限量值附近時，實驗室出具的檢測結果直接關系到樣品是否合格的判定。因此，為確保結果的可信度，必須進行不確定度的評估[5]。

1 材料與方法

1.1 材料儀器與試劑

蔬菜，購于廣州某超市。

TSQ8000evo型氣相色譜-三重四極桿質譜儀、EI離子源，美國Thermo Scientific公司產品；BP221S型電子天平，美國賽多利斯公司產品；2-16KL型高速離心機，德國Sigma公司產品；HS501型數顯往復振蕩搖床，德國IKA儀器設備有限公司產品。

苯醚甲環唑（100 μg/mL），農業部環境保護科研檢測所提供；環氧七氯、乙腈（色譜純），美國Fisher公司提供；QuEChERS分散固相萃取鹽包（內含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g三水合二檸檬酸二鈉）、QuEChERS分散固相萃取凈化管（150 mg PSA和900 mg MgSO4）、陶瓷均質器，美國Agilent公司提供。

1.2 試驗條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：TR-PESTICIDEⅡ毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始柱溫40℃，保持1.5 min，以 25 min/℃升至90℃，保持1.5 min，以25 min/℃升至180℃，以5℃/min升至280℃，再以10 min/℃升至300℃，保持5 min；進樣口溫度270℃，進樣量1 μL，不分流；載氣為高純氦氣，1.2 mL/min。

1.2.2 質譜條件

離子源溫度300℃，傳輸線溫度300℃，EI離子源70 eV。

定性、定量離子和碰撞能見表1。

表1 定性、定量離子和碰撞能

1.2.3 標準儲備液及內標溶液的配制

準確稱取25 mg環氧七氯標準物質，用正己烷溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL的溶液，作為內標的標準儲備液；準確吸取200 μL的內標標準儲備液，正己烷定容至10 mL，得到20 mg/L的內標工作溶液。精確吸取苯醚甲環唑標準溶液1 mL，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到10 mg/L的標準工作溶液。

1.2.4 標準曲線的制備

準確吸取 0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 mL的標準溶液于10 mL容量瓶中，準確各加入50 μL的20 mg/L內標工作溶液，用蔬菜的基質空白溶液定容。以苯醚甲環唑濃度與內標物濃度的比值（C苯醚甲環唑/C內標）為橫坐標、苯醚甲環唑峰面積與內標物峰面積（A苯醚甲環唑/A內標） 的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 前處理方法

（1） 提取。均勻取樣并準確稱取樣品10 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中， 加入20 mg/L的內標工作溶液100 μL，加入20 mL的乙腈，于組織搗碎機上提取2 min，置于-18℃冰箱中冷凍10 min后取出，加入QuEChERS萃取包、2粒均質子，劇烈振搖1 min后，以轉速8 000 r/min離心3 min。

（2） 凈化。分取上清液 5 mL于QuEChERS凈化管中，劇烈振搖1 min后，以轉速8 000 r/min離心3 min，上清液過濾膜后，用氣相色譜-三重四極桿質譜儀測定。以保留時間和離子對豐度比定性，內標曲線法定量。

1.2.6 回收率的測定

準確稱取各10.00 g空白蔬菜樣品6份，于50 mL離心管中，加入相同質量濃度苯醚甲環唑標準和內標，按1.2.5前處理方法同步進行，測定苯醚甲環唑的含量，并對其回收率和精密度進行計算。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

從測定苯醚甲環唑的數學模型中，分析其不確定度的來源。就試驗而言，采用內標法計算樣品中苯醚甲環唑殘留量的計算公式為：

式中：X——樣品中苯醚甲環唑的含量，mg/kg；

C——由A樣/A內標從曲線中得出的試樣中苯醚甲環唑的質量濃度，mg/L；

V——提取液體積，mL；

m——稱量質量，g；

frec——加標試驗的回收率，%；

根據JJF 1059—1999[6]，由相對標準不確定度合成標準不確定度，合成標準不確定度公式為：

2.2 試驗結果

取6個加標的蔬菜樣品，按照1.2.5的處理方法對蔬菜樣品中苯醚甲環唑進行平行6次的試驗，對其含量進行測定。

測定結果見表1。

表1 測定結果

由表1可以計算出本次試驗測定的苯醚甲環唑含量為：

3 不確定度評定

3.1 不確定度的來源分析

根據內標法原理，被測樣品和標準系列溶液中加入的內標物相同，即內標物的濃度可約除，因此無需考慮內標物純度引起的不確定度，只考慮內標物加入的體積?？v觀整個檢測過程，對蔬菜中苯醚甲環唑殘量結果有影響的不確定度分量來源有標準物質、樣品、樣品前處理過程、儀器分析過程等。

3.2 標準物質引起的不確定度Urel(標)

3.2.1 標準物質濃度引起的不確定度Urel(標p)

苯醚甲環唑標準溶液購自農業部環境保護科研檢測所，根據證書信息，苯醚甲環唑的標準值為100 μg/mL，擴展不確定度為 0.19 μg/mL。

3.2.2 標準溶液配制過程引起的不確定度Urel(標v)

試驗的標準儲備液的配制過程使用了10 mL的容量瓶（A級），標準曲線配制過程使用了100 μL和1 mL移液器，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[7]和JJG 646—2006《移液器》[8]檢定規程，玻璃器和移液器均有相應的最大允許誤差，其不確定來源包括以下2個方面。

（1）容量瓶、移液器本身的不確定度。檢定證書指出10 mL容量瓶（A級）的最大允差為±0.020 mL，100 μL移液器的最大允差為±2.0%，1 mL移液器最大允差為±1.0%，由量具允差引入的相對標準不確定度公式為：

（2）環境溫度引起的不確定度。實驗室的溫度一般控制在20±5℃，20℃時乙腈的膨脹系數是1.37×10-3℃，由環境溫度引起的相對不確定度公式為：

根據各分量合成標準溶液的配制過程中引入的相對不確定度為：

玻璃器具和移液器的相對標準不確定度見表2。

3.2.3 標準校正曲線擬合的不確定度Urel(標w)

試驗對6個不同濃度的苯醚甲環唑進行測定。內標校正曲線見表3。

表2 玻璃器具和移液器的相對標準不確定度

表3 內標校正曲線

以系列標準溶液中苯醚甲環唑與內標物質量濃度比值為橫坐標，苯醚甲環唑與內標物豐度比值為縱坐標，得到的回歸方程為Y=4.618X-0.193 1，R2=0.999 3。

計算標準溶液待測物質信號殘差的標準差為：

對苯醚甲環唑為陰性的蔬菜樣品進行5次的添加回收試驗（添加量為0.2 mg/kg）。

樣品測定結果（n=5） 見表4。

表4 樣品測定結果（n=5）

校準曲線擬合的標準不確定度為：

式中：S——標準溶液待測物質信號殘差的標準差，0.1；

b——標準曲線的斜率，4.618；

P——試驗次數，5；

n——標準曲線的濃度點數，6；

C0——樣品中苯醚甲環唑的實際測定濃度，0.105 2；

cˉ——各標準溶液濃度平均值，0.64；

Sn——所有校準溶液濃度的離均差平方和。

則曲線擬合的引入的相對不確定度為Urel(標w)=U(std)/1.052=0.084/1.052=0.079 8.

綜上分析，根據標準品物質所引入的不確定度來源，計算由標準物質引入的相對標準合成不確定度為：

3.3 儀器重復測量引入的不確定度Urel(儀)

儀器引入的不確定度是由儀器對被測組分的響應值（峰面積）的重復性差異引起的，按A本類評定，可通過重復進樣來計算。通過將同一樣品溶液進行連續6次重復進樣，得到的重復進樣結果。

重復進樣測定結果見表5。

表5 重復進樣測定結果

根據標準[6]，在測定次數少的情況下，可采用極差法對不確定度進行評定，查表可得，當n=6，C=2.53。即由重復性進樣引入的標準不確定度和相對標準不確定度為：

3.4 樣品前處理中引起的不確定度Urel(樣)

樣品處理過程不確定度的主要來源：一是樣品使用的稱量天平引起的不確定度；二是樣品提取、凈化、定容等過程中所使用的玻璃量器所引起的不確定度。

樣品用百分之一天平進行稱量，其校準允差為±0.01g，試驗稱取樣品量為10 g，k按均勻分布計算，K??；樣品凈化、定容過程中使用的是20 mL的移液管。

天平和玻璃量器引起的不確定度見表6。

由表6可知，樣品前處理過程所引起的相對標準不確定度合成為：

3.5 結果計算過程引入的不確定度Urel(frec)

回收率是結果計算中的一個重要的不確定度來源因子。取低、中、高3個水平進行苯醚甲環唑的添加回收試驗，每個水平進行6次試驗，按照2.2.5步驟進行處理上機。對18次的測定結果進行添加回收率計算。

表6 天平和玻璃量器引起的不確定度

回收率結果統計見表7。

表7 回收率結果統計

回收率按A類不確定度進行評定計算，當n=18，

則，由回收率引入的標準不確定度為：

由回收率引入的相對標準不確定度為：

4 不確定度的合成及擴展

4.1 各相對標準不確定度分量的合成

各相對標準不確定度分量見表8。

表8 各相對標準不確定度分量

苯醚甲環唑的相對合成不確定度為：

折算合成標準不確定度為：

4.2 擴展不確定度的評定

取置信水平為95%，k=2，計算擴展不確定度U(C)=u(C)×k=0.017×2=0.034。因此，樣品中苯醚甲環唑的殘留量表示為（0.2±0.0.034） mg/kg（k=2）。

5 結論

以苯醚甲環唑為主要研究對象，對蔬菜中苯醚甲環唑的不確定度評估進行了論述。當取樣量為10 g，k=2（95%置信度） 測得的蔬菜中苯醚甲環唑的含量為（0.2±0.034） mg/kg。表明整體方法的準確性較好，可用于蔬菜中苯醚甲環唑的測定和不確定評估。