玻璃化凍融助孕胎盤DNMT1、GCN5、HDAC1 表達研究

林冠 祁偉 杜生榮 林典梁 易勁松

體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），是重要的輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）。玻璃化冷凍作為ART 重要的輔助技術，已得到廣泛應用。其應用快速降溫法及冷凍保護劑，使細胞外周呈玻璃態，同時細胞內不產生冰晶，減少了滲透壓及激冷的變化對細胞內外造成的機械損傷。配子和胚胎發育早期是表觀遺傳修飾的關鍵時期，基因印記（genomic impriting）也在此期間擦除和重建。表觀遺傳效應在哺乳動物胚胎發育早期中起重要的作用，但目前尚無確切證據表明包括玻璃化冷凍在內的技術是否對此時期的表觀遺傳修飾產生影響[1]。DNA 與組蛋白共同組成核小體，是染色質的基本組成單位；組蛋白可以通過共價修飾發生甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等改變,籍此組成各式各樣的組蛋白密碼，傳遞不同的遺傳信息。就組蛋白修飾（histone modification）的形式而言，甲基化修飾是最穩定、最具代表性的，而乙?；瘎t有較高的可變性。在表觀遺傳學修飾中，DNA 甲基化被廣泛研究，DNA 甲基轉移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）是催化DNA 甲基化（DNA methylation）的關鍵，其表達水平可間接反映DNA 甲基化水平。組蛋白乙?；绞怯山M蛋白乙?；D移酶（histone acetyltransferases，HATs）和去乙?；福╤istone deacetytransferases，HDACs）共同維持，而HATs 和HDACs 最關鍵、具代表性的酶分別是組蛋白乙?；D移酶GCN5（general control of nucleotide synthesis， GCN5）和組蛋白去乙?；?（histone deacetylase1， HDAC1）。GCN5 及HDAC1 均表達在細胞核內，不僅共同維持組蛋白乙?；腿ヒ阴；钠胶?，也同時調控基因。胎盤被認為是胎兒表型的主要決定因素，可作為用于分析與生長和發育結果相關的印跡基因表達譜的適當組織[1-2]。而GCN5、HDAC1 和DNMT1 可作為印跡基因的代表，故通過研究助孕妊娠婦女胎盤中上訴基因的表達情況，可以從表觀遺傳角度評估玻璃化凍融囊胚助孕技術的安全性。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年5 月—2016 年5 月間在福建省婦幼保健院以玻璃化凍融囊胚助孕妊娠并分娩的婦女50 例（觀察組）、按年齡配對選擇同期自然妊娠婦女50 例（對照組）的胎盤標本和臨床資料。分析比較兩組孕婦的人口學資料，差異無統計學意義（ P ＞0.05）。兩組孕婦均長期留居本地，其年齡、民族、文化程度和受教育情況等均無顯著差異。本研究方案經由福建省婦幼保健院醫學倫理委員會討論通過，經研究對象充分知情同意并獲得患方夫妻雙方書面簽字后實施。入選標準：受孕年齡在20 ～35 歲；首次妊娠；既往身體健康無高血壓、糖尿病、血液病等病史。排除標準：孕24 周前妊娠丟失。所有孕婦均分別記錄姓名、末次月經、孕周、預產期、分娩方式、分娩孕周、妊娠合并癥、并發癥等情況。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標本采集 孕婦分娩后立即收集胎盤組織，仔細檢查并測量胎盤大小及重量，記錄所有相關數據。避開胎盤梗死、鈣化和血管瘤部分，從臍帶插入點旁開5 cm 處縱向切開胎盤組織，收集胎盤中間部位絨毛組織；存在異常臍帶植入（如帆狀胎盤）者除外。加入4%多聚甲醛固定液用于免疫組織化學分析。

1.2.2 免疫組織化學法檢測胎盤組織中DNMT1、GCN5 和HDAC1 的表達 將組織的石蠟標本制成3 ～5 μm 厚切片，石蠟組織切片標本依次經過脫蠟、沖洗、抗原修復，消除內源性過氧化物酶活性，滴加封閉血清，封閉非特異性結合位點，分別滴加一抗和二抗，孵育、DAB 顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。分別對試驗組和對照組進行100×和400×的顯微照相。結合鏡下觀察所見陽性細胞占所觀察同類細胞數的百分比和陽性細胞著色強度兩項標準，半定量判斷結果。按以下評分標準：A為陽性細胞數分級：0 ～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B 為陽性細胞著色強度分級：0（不著色，陰性）、1（淺黃色，弱陽性）、2（棕黃色，陽性）、3（棕褐色，強陽性）；IHS=A×B。對所有胎盤組織切片均進行鏡下觀察，分析DNMT1、GCN5 和HDAC1 蛋白的表達。

1.3 統計學方法

使用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用 （）表示，采用t 檢驗；計數資料用（n，%）表示，采用χ2檢驗，不適用χ2檢驗者，則用Fisher 確切概率法。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤稱量結果比較

胎盤稱量結果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕組胎盤重量、胎盤面積均顯著大于自然妊娠組，差異有統計學意義（P ＜0.05），如表1 所示。

2.2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤DNMT1 免疫組化分析

免疫組織化學染色結果顯示，兩組病例中胎盤滋養層細胞均可見DNMT1 的表達，如圖1 所示。表2 所示為兩組胎盤DNMT1的表達差異。兩組胎盤組織DNMT1 蛋白在表達率、表達強度、IHS 方面差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

圖1 胎盤DNMT1 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組；B 自然妊娠組）

2.3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤GCN5 免疫組化分析

免疫組織化學染色結果顯示，兩組樣本中胎盤滋養層細胞均可見不同程度GCN5 蛋白的表達，如圖2 所示。兩組胎盤組織GCN5 表達率、表達強度、IHS 比較上均差異無統計學意義（P ＞0.05）。詳見表3。

圖2 胎盤GCN5 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕組；B 自然妊娠組）

表1 玻璃化凍融囊胚組與自然妊娠組胎盤稱量結果比較 （ ）

表1 玻璃化凍融囊胚組與自然妊娠組胎盤稱量結果比較 （ ）

組別 胎盤重量（g） 胎盤面積（cm2）玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 792.26±242.95 870.18±364.82自然妊娠組（n=50） 642.40±111.65 743.68±208.29 t 值 3.963 2.129 P 值 ＜0.001 0.036

表2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織DNMT1 表達免疫組化結果 （ ）

表2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織DNMT1 表達免疫組化結果 （ ）

組別 DNMT1 表達率% DNMT1 表達強度 DNMT1 IHS玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 22.36±5.43 1.80±0.67 43.68±25.82自然妊娠組（n=50） 22.04±5.28 1.74±0.60 41.12±22.59 t 值 0.299 0.472 0.528 P 值 0.766 0.638 0.599

表3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織GCN5 表達免疫組化結果 （ ）

表3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織GCN5 表達免疫組化結果 （ ）

組別 GCN5 表達率% GCN5 表達強度 GCN5 IHS玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 18.36±5.17 1.68±0.47 33.20±15.47自然妊娠組（n=50） 18.06±4.97 1.58±0.50 30.52±15.12 t 值 0.296 1.031 0.876 P 值 0.768 0.305 0.383

表4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組病例胎盤組織HDAC1 表達免疫組織化學分析結果 （）

表4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組病例胎盤組織HDAC1 表達免疫組織化學分析結果 （）

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表5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產科結局比較 （ ）

表5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產科結局比較 （ ）

玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 自然妊娠組（n=50） t/χ2 值 P年齡（歲） 26.44±1.94 26.20±2.25 0.571 0.569分娩孕周（周） 38.02±1.78 38.64±1.95 1.663 0.099胎兒發育早產兒（%） 3 （6.00） 6（12.00） - 0.487足月兒（%） 47（94.00） 44（88.00） - 0.487妊娠期并發癥 - -先兆流產（%） 12（24.00） 1（2.00） 10.698 0.001胎膜早破（%） 6（12.00） 5（10.00） 0.102 0.743胎位異常（%） 3（6.00） 2（4.00） - 1.000羊水過多（%） 1（2.00） 1（2.00） - 1.000妊娠期高血壓疾?。?） 1（2.00） 0 - 1.000妊娠期糖尿?。?） 3（6.00） 4（8.00） 0.083 0.773臍帶異常（%） 14（28.00） 5（10.00） 0.493 0.482胎盤早剝（%） 0 1（2.00） - 1.000產后出血（%） 2（4.00） 1（2.00） - 1.000妊娠合并癥 - -貧血（%） 3（6.00） 1（2.00） - 0.617甲亢（%） 0 1（2.00） - 1.000分娩方式 - -順產（%） 13（26.00） 36（72.00） 19.368 ＜0.001

2.4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤HDAC1 免疫組化分析

免疫組織化學染色結果顯示，兩組樣本中胎盤滋養層細胞均有HDAC1 蛋白的表達，如圖3 所示。兩組胎盤HDAC1 的表達比較見表4。兩組胎盤中HDAC1 在表達率、表達強度、HIS 評分方面差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

圖3 胎盤HDAC1 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕組；B 自然妊娠組）

2.5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產科結局比較

觀察組及對照組產科結局比較結果表5 所示：玻璃化凍融囊胚助孕組先兆流產風險、剖宮產率均高于自然妊娠組（P ＜0.05）；而其在分娩孕周、早產率、妊娠期并發癥、妊娠合并癥、分娩方式的組間差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

3 討論

表觀遺傳學屬于研究細胞調控基因表達的一門學科，其研究基因在其遺傳密碼或核苷酸序列不改變的狀態下表達可遺傳的變異的機制[3]。目前已了解的表觀遺傳現象包括有基因組印記[4]、DNA 甲基化、組蛋白修飾、基因沉默（gene silencing）、休眠轉座子激活等?；蚪M印記指來自精子和卵子的等位基因在形成合子細胞后進行通過修飾、使得子代的等位基因只單獨表達父系或母系的遺傳信息的現象，以DNA 甲基化最為常見。原始生殖細胞早期分化中，通過等位基因的甲基化，大部分表觀遺傳信息被刪除，然后合子的基因組開始進行第一輪表觀遺傳重編程[4-5]。若印記基因改變發生在配子形成和植入前生長發育階段，可破壞正常的生長和發育，導致印記基因表達異常，常引起眾多伴隨有突變和表型缺陷的疾病[6-7]。人工輔助生殖技術使得配子形成的場所轉到了人工構建的環境下，有研究認為不同的培養環境和操縱技術對印記基因表達有影響，可能導致此階段的錯誤隨機發生[6-8]。玻璃化冷凍技術使用高濃度的乙二醇（EG）等冷凍保護劑以達到快速、不結冰晶、減少細胞損傷風險的效果；但有報道可使參與表觀修飾的關鍵蛋白酶（如Dnmt3等）表達下降，可能會影響組蛋白修飾及DNA 甲基化狀態，影響表觀遺傳修飾，從而引起表觀遺傳的改變[9-10]。

胎盤是印記基因表達的主要器官之一[11]，胎盤滋養層細胞能否正常發育、分化直接影響著胎盤的生長及功能。而印跡基因的異?；蚩捎绊懱ケP結構，影響胚胎的發育，造成胎源性疾病的產生。有研究通過動物模型發現輔助生殖可影響胎盤發育及其功能，致胎盤效率下降，進而影響胎兒宮內發育及出生體質量;同時還發現，輔助生殖操作可通過干擾早期胚胎表觀印跡影響胎盤發育及功能，進而影響胎兒發育及出生體質量[12]。本研究通過比較兩組胎盤組織中DNMT1，GCN5 和HDAC1 蛋白在表達率、表達強度、IHS 評分的不同，發現其均無顯著性差異，提示玻璃化凍融操作未對上述與表觀修飾相關酶的表達產生影響，間接說明該項助孕技術所構建的胚胎與自然受孕的胚胎無明顯的表觀遺傳學差異。表觀遺傳修飾依賴于各種蛋白酶與相關蛋白結合，而慢速冷凍形成的冰晶可能影響蛋白質活性，進而影響基因編輯過程。玻璃化冷凍抑制細胞內外冰晶的形成，并防止滲透性休克，從而減少對活細胞及蛋白質的損害，在不改變表觀遺傳修飾的情況下，能提高卵母細胞復蘇后的成功率[13]。但本研究只對以上三種表觀遺傳修飾相關蛋白酶進行了分析，為全面評估玻璃化凍融囊胚的表觀遺傳基因表達，有待于擴展基因種類、擴大樣本例數以進一步研究。

本研究顯示玻璃化凍融囊胚助孕組胎盤重量和面積大于自然受孕組，這與國內外主流研究結果相符[14-15]。本研究又分別對觀察組與對照組的一些產科結果進行比較，結果顯示觀察組先兆流產發生率、剖宮產率均較對照組顯著升高（P ＜0.05），而其他觀察指標比較均無差異。流產原因多種多樣，其與包括DNA 甲基化在內的表觀遺傳修飾所導致的胚胎不健全、胎盤形成異常是否有關目前尚無定論；而在人口基數大的我國，出于多種考量，輔助生殖受孕本身即是剖宮產指征，故不能單憑以上兩率升高而否定輔助生殖技術。國內喬杰院士團隊[16]的一項薈萃分析通過分析快速冷凍程序對胚胎存活率、成熟率、受精率等和臨床風險率的風險比，也認為與新鮮和慢速冷凍程序相比，成熟卵母細胞和胚胎的玻璃化獲得了更好的臨床結果，且沒有增加DNA損傷、基因組印記、和胚胎非整倍性的風險。賀麗人等[17]也回顧分析1 237 例接受ART 成功妊娠和5 040 例自然受孕的圍產結局，結果顯示ART 組的剖宮產率、多胎妊娠率、前置胎盤、妊娠期高血壓、妊娠期肝內膽汁淤積癥、產后出血、早產和低出生體質量率等均顯著高于自然受孕組。這些研究的部分結論也與此次研究結果一致，即玻璃化凍融囊胚助孕是一項安全的人工輔助生殖技術，可獲得與自然妊娠相似的妊娠結局。但本研究時限較短，納入樣本量有限，亦有待于擴大樣本容量、延長研究周期以進一步印證。

綜上，玻璃化凍融囊胚助孕技術不改變胎盤中GCN5，HDAC1 和DNMT1 的表達，且不增加妊娠期產科主要并發癥及圍產兒風險；但有可能與先兆流產和剖宮產的發生率增加有關。在目前，該技術是一種安全有效的助孕技術。