凍融囊胚的發育天數和質量對妊娠結局的影響

柴娟 余柯達 包云 師帥 鄒立波

近年來輔助生殖技術中的胚胎培養體系和胚胎環境變得更完善，胚胎種植率得到了顯著提高，使多胎妊娠率成為了輔助生殖技術中的一個嚴重并發癥，其可誘發流產、貧血、早產、妊娠高血壓綜合征和前置胎盤等妊娠并發癥。因此在不降低臨床妊娠率的前提下，如何減少多胎妊娠率成為國內外研究的重點。目前部分生殖醫學中心采用單囊胚移植來替代雙卵裂期胚胎移植，以實現單胎妊娠的體外受精/卵胞漿內單精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）理想結局[1]，且研究結果表明單囊胚移植不會使臨床妊娠率和活產率降低[2-4]。但上述研究中所移植的囊胚均為優質囊胚，未見細分不同發育天數及質量的囊胚移植數目對妊娠結局影響的報道。本研究根據凍融囊胚的發育天數分別進行分析，并根據囊胚的質量決定移植數目，以探討第5日（D5）和第6日（D6）不同質量的囊胚移植數目對妊娠結局的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年8月至2020年1月在金華市人民醫院生殖醫學中心行凍融囊胚移植者的1 425個周期，所有囊胚采用玻璃化冷凍復蘇法進行冷凍、復蘇。納入標準：（1）患者年齡＜40 歲；（2）無子宮畸形、合并子宮肌瘤和子宮腺肌病等；（3）無習慣性流產史；（4）無遺傳性及家族性病史。凍融囊胚移植周期根據囊胚形成時間分為D5組874個周期與D6組551個周期，再根據移植囊胚質量和個數將D5/D6組分為單優質囊胚移植組、優質囊胚+非優質囊胚移植組和雙非優質囊胚移植組。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 囊胚培養與評分 患者均采用常規長方案行促排卵治療，取卵日為第 0日（D0），行IVF/ICSI，于第 1日（D1）觀察受精情況，雙原核為正常受精，胚胎培養采用瑞典Vitrolife序貫培養基培養，于D5和D6觀察囊胚形成情況及形態。囊胚評分采用Gardner評分標準[5]，將D5評分在3BB及以上的囊胚定為優質囊胚，3CC以上除去優質囊胚的囊胚定為非優質囊胚；或D6在4BB及以上的囊胚定為優質囊胚，4CC以上除去優質囊胚的囊胚定為非優質囊胚。

1.3 囊胚玻璃化冷凍與復蘇 囊胚采用玻璃化冷凍液（日本加藤公司）進行冷凍保存，冷凍前進行激光破膜，完全皺縮后將其放入平衡液（ES）中平衡10 min,隨后放入玻璃化冷凍液（VS）中，60 s內將囊胚轉移至冷凍載體Cryotop（日本加藤公司）上，迅速投入液氮中保存。囊胚復蘇采用玻璃化解凍液（日本加藤公司），將Cryotop從液氮中取出后迅速放入解凍液（TS，預熱至37℃）中1 min，然后依次將囊胚移至稀釋液（DS）、洗滌液 1 和洗滌液 2（WS1、WS2）中各 3、5 和 1 min，最后放入G-2 PLUS（瑞典Vitrolife公司）中培養，復蘇后2 h觀察囊胚的存活情況。

1.4 凍融囊胚移植 所有患者均采用人工周期進行內膜準備，即從月經的第3天口服補佳樂6 mg/d（德國Bayer公司，1 mg/片），或從月經的第3天口服芬嗎通（紅片）6 mg/d（美國雅培公司，2 mg/片），連用兩周后行B超檢查及雌二醇、孕酮測定，根據患者情況，加用黃體酮針（浙江仙琚制藥股份有限公司）80 mg/d肌肉注射進行內膜轉化，于第5天行囊胚移植。移植后4周進行B超檢查，子宮腔內見孕囊及原始心管搏動為臨床妊娠。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義；計數資料組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水平，以 P＜0.05/n（n=3，P＜0.0167）為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D5組和D6組凍融囊胚移植的妊娠結局比較 D5組和D6組年齡、BMI、不孕年限、基礎促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、內膜厚度、移植胚胎數、異位妊娠率和多胎妊娠率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；D5組種植率和臨床妊娠率均高于D6組，且早期流產率低于D6組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

2.2 D5囊胚移植對妊娠結局的影響 不同移植囊胚質量和個數3組患者年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、內膜厚度和異位妊娠率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但種植率、臨床妊娠率、早期流產率和多胎妊娠率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較發現，單優質囊胚移植組種植率高于優質囊胚+非優質囊胚移植組和雙非優質囊胚移植組（均P＜0.0167），優質囊胚+非優質囊胚移植組種植率高于雙非優質囊胚移植組（P＜0.0167）；優質囊胚+非優質囊胚移植組臨床妊娠率高于單優質囊胚移植組（P＜0.0167）；雙非優質囊胚移植組早期流產率高于單優質囊胚移植組（P＜0.0167）；不同移植囊胚質量和個數3組多胎妊娠率的變化趨勢與種植率相反，單優質囊胚移植組最低，雙非優質囊胚移植組次之，優質囊胚+非優質囊胚移植組最高（均 P＜0.0167），見表 2。

2.3 D6囊胚移植對妊娠結局的影響 不同移植囊胚質量和個數3組患者年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、內膜厚度和異位妊娠率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但種植率、臨床妊娠率、早期流產率和多胎妊娠率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較發現，單優質囊胚移植組和優質囊胚+非優質囊胚移植組種植率均高于雙非優質囊胚移植組（均P＜0.0167）；優質囊胚+非優質囊胚移植組臨床妊娠率高于單優質囊胚移植組，但多胎妊娠率也高于單優質囊胚移植組（均P＜0.0167）；單優質囊胚移植組和優質囊胚+非優質囊胚移植組早期流產率均低于雙非優質囊胚移植組（均 P＜0.0167），見表 3。

3 討論

隨著囊胚玻璃化冷凍與復蘇技術的不斷改進，其復蘇率、種植率和臨床妊娠率等得到了極大的提升。囊胚玻璃化冷凍與復蘇已成為輔助生殖技術中不可或缺的技術手段，其不僅可提高累計臨床妊娠率，還可降低多胎妊娠及卵巢過度刺激的風險。在囊胚新鮮移植周期中，D5囊胚的種植率和臨床妊娠率顯著高于D6囊胚[6]。本研究凍融移植周期結果也表明D5凍融囊胚移植后的種植率和臨床妊娠率均高于D6凍融囊胚，流產率低于D6凍融囊胚，且多胎妊娠率與D6凍融囊胚比較差異無統計學意義，與李誠等[7]的研究結果一致。Elgindy等[8]還發現D5囊胚在解凍移植周期的D5或D6進行移植，臨床妊娠率不會改變，但D6囊胚的臨床妊娠率顯著下降。發育遲緩的囊胚比正常發育的囊胚臨床妊娠率低，原因可能與D6囊胚中的異常紡錘體的發生率顯著高于D5囊胚有關，導致D6囊胚具有較高的非整倍體率[9]。Kadar等[10]也認為D6囊胚與D5囊胚相比，D6囊胚的細胞DNA損傷更多，且發育速度較D5囊胚有所延遲，因此在胚胎質量上會稍差于D5囊胚，所以導致相同質量下D6囊胚的種植率低于D5囊胚。因此建議IVF/ICSI周期中優先移植D5囊胚。

表1 D5組和D6組凍融囊胚移植的妊娠結局比較

表2 D5囊胚移植對妊娠結局的影響

表3 D6囊胚移植對妊娠結局的影響

為了降低多胎妊娠的風險，囊胚培養和單囊胚移植成為了國內外各大生殖醫學中心的首選技術[1]。囊胚培養后胚胎的非整倍體率進一步降低[11]，且囊胚移植可改善子宮和胚胎的同步性，從而提高種植率[12]。然而，在決定要移植囊胚個數前，有許多因素會對臨床妊娠率產生影響，囊胚質量是其中的關鍵因素。囊腔擴張程度、內細胞團（inner cell mass，ICM）和滋養層細胞（trophectoderm，TE）等囊胚質量相關指標與新鮮/冷凍囊胚移植后的種植率和活產率有關[13-14]。鑒于囊胚形態學與活產率之間的相關性，根據Gardner評分，玻璃化冷凍并進行復蘇移植的通常僅限于囊腔擴張程度評分為3～5期的囊胚，以及ICM/TE的最低等級為B，即優質囊胚[5]。在IVF/ICSI周期中，并非所有周期都能獲得優質囊胚，尤其是高齡或卵巢低反應患者，對于這些患者移植非優質囊胚是否可以得到臨床妊娠是非常重要的。然而，關于玻璃化冷凍后非優質囊胚著床潛能的現有數據非常有限。

本研究探討了不同質量凍融D5/D6囊胚移植數目對妊娠結局的影響。凍融D5囊胚移植后妊娠結局如下，3組種植率/臨床妊娠率分別高達54.63%/54.63%、42.08%/68.61%和35.60%/64.40%，均高于本中心移植雙D3優質胚胎的種植率/臨床妊娠率[15]。雙非優質囊胚移植組早期流產率高于單優質囊胚移植組和優質囊胚+非優質囊胚移植組。3組多胎妊娠率分別為0.89%、22.67%和10.55%，優質囊胚+非優質囊胚移植組高于單優質囊胚移植組和雙非優質囊胚移植組。這一結果顯示，移植單優質D5囊胚在保證較高種植率的條件下，可減少多胎妊娠的風險，與Mullin等[4]研究結果一致。非優質D5囊胚則考慮行雙胚胎移植，較高的臨床妊娠率，可以抵消部分早期流產率高的影響，保證其有較高的活產率，且其多胎妊娠率較低。凍融D6囊胚移植后，3組臨床妊娠率分別為35.71%、54.10%和43.08%，優質囊胚+非優質囊胚移植組臨床妊娠率高于單優質囊胚移植組；但單優質囊胚移植組種植率高達35.71%，優質囊胚+非優質囊胚移植組和雙非優質囊胚移植組僅為30.94%和22.82%，單優質囊胚移植組最高；且早期流產率和多胎妊娠率單優質囊胚移植組最低。雙非優質囊胚移植組種植率和早期流產率均差于單優質囊胚移植組和優質囊胚+非優質囊胚移植組。上述結果提示，移植D6囊胚的策略與D5囊胚一致，移植單優質D6囊胚具有最佳的臨床結局，而非優質D6囊胚則考慮行雙胚胎移植。

綜上所述，D5凍融囊胚移植后的種植率和臨床妊娠率顯著高于D6凍融囊胚，且D5/D6非優質囊胚的種植率均顯著低于優質囊胚，結果表明可以通過囊胚發育速度和囊腔擴張程度、ICM與TE等囊胚形態學相關指標預測囊胚移植后的臨床妊娠結局。本研究建議IVF/ICSI周期中優先移植D5囊胚，優質囊胚行單囊胚移植，非優質囊胚則行雙囊胚移植。以上移植策略可以在保證獲得臨床妊娠的同時，盡量減少多胎妊娠的風險。