扳倒井酒用微生物的分離鑒定及功能性、抗逆性研究

董喬娟，于文娟，許 玲，姜明慧，于盼盼，楊慶振，白秀彬，趙紀文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

傳統大曲生產與白酒釀造為開放性的固態發酵方式，從而形成了“多微共酵”的發酵體系，是影響白酒風格和品質的重要基礎。對于白酒釀造微生物的研究，多集中于功能微生物的分離、篩選、鑒定及應用。在白酒釀造中大量寶貴的微生物資源，對后期應用生產實驗，穩定并提高白酒的風格和品質提供基礎與保障[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 供試材料

扳倒井高溫大曲、扳倒井發酵酒醅、扳倒井窖泥。

1.1.2 培養基

細菌分離培養基：營養瓊脂；酵母菌、霉菌分離培養基：孟加拉紅培養基；細菌保藏培養基：同細菌分離培養基；酵母菌保藏培養基：麥芽汁瓊脂培養基；霉菌保存培養基：察氏培養基；細菌種子培養基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%；酵母菌種子培養基：玉米糖化液；麩皮固體培養基；細菌液體培養基：同細菌種子培養基；酵母菌液體培養基：麥芽浸粉肉湯；霉菌液體培養基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%。

1.1.3 儀器設備

HIRAYAMA HVE-50 立式自動滅菌器、ESCO CLASSII BSC AC2-6S1 生物安全柜、Bio-Cinerator紅外接種環滅菌器、QL-901 振蕩器、江蘇太倉DHZ-CA大容量振蕩器、上海一恒GPH-9160"隔水式恒溫培養箱、上?；芫GDHG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱、上海博迅HHS-21-8 數顯恒溫水浴鍋、普析通用T6 新世紀紫外可見分光光度計、OLYMPUSCX41 光學顯微鏡、德國Eppendorf 5424R 型高速冷凍離心機、德國Biometra Tone 96 型臺式PCR擴增儀、君意東方JY330C 瓊脂糖凝膠電泳儀、君意東方JY04S-3C凝膠成像分析系統等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化

微生物的分離培養采用稀釋平板涂布法。準確稱取25 g 樣品，置入裝有225 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min，放入30 ℃培養箱中靜置30 min。

用移液槍吸取1 mL 震蕩均勻的菌懸液，置入裝有9 mL 無菌水的試管中，振蕩均勻，進行系列稀釋，依次稀釋到10-6。選取10-3、10-4、10-5、10-64 個稀釋梯度分別在營養瓊脂和孟加拉紅平板上進行涂布，營養瓊脂平板于37 ℃下倒置培養24 h；孟加拉紅平板于28 ℃下倒置培養2～3 d。

培養結束后，挑取平板上生長出的單菌落，繼續進行多次劃線等純培養操作，直至平板上菌落形態單一為止。編號，接種于斜面試管中保藏[3]。

1.2.2 菌株的形態特征觀察

宏觀形態觀察：將細菌接種到營養瓊脂培養基上，35 ℃恒溫培養2 d，觀察菌落特征；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d，觀察菌落特征；將霉菌接種到察氏培養基上，28 ℃恒溫培養5～7 d，觀察菌落特征。

微觀形態觀察：將細菌接種到營養瓊脂培養基上，35 ℃恒溫培養2 d，用接種環挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×100 倍油鏡下進行觀察；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d，用接種環挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×40 倍顯微鏡下進行觀察；將霉菌接種到察氏培養基上，28 ℃恒溫培養5～7 d，取1 滴棉蘭染色液置于載玻片中央，用透明膠帶在菌落邊緣粘取少量菌體，覆于染色液上，置于10×40 倍顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定

DNA 的提取使用天根基因組DNA 提取試劑盒。細菌采用16S rDNA 分子生物學鑒定，引物設計為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；酵母菌采用ITS 分子生物學鑒定，引物設計為ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；霉 菌 采用BT 分子生物學鑒定，引物設計為Bt2a：5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'和Bt2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。利用PCR 擴增技術分別對16S rDNA、ITS 和BT 進行擴增后送樣測序，測序工作由上海生工完成。

1.2.4 菌株的凍干管制備及入庫保藏

以脫脂牛奶為保護劑，將篩選得到的高酶活菌株和抗逆菌株進行凍干管制備，保存至扳倒井微生物菌種資源庫，相關菌種信息錄入扳倒井微生物菌種信息管理系統。

1.2.5 高酶活菌株的篩選

取新鮮活化細菌，接種于細菌種子培養基中，以37 ℃、180 r/min 搖床培養過夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態培養基，接種量為5%,于37 ℃培養箱中培養72 h。40 ℃烘干備用。

取新鮮活化酵母菌，接種于酵母菌種子培養基中，于28 ℃、140 r/min 搖床培養過夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態培養基，接種量為10%,于28 ℃培養箱培養72 h，40 ℃烘干備用。

霉菌直接挑取菌體接種于麩皮固態培養基，25 ℃培養5～7 d，40 ℃烘干備用。

淀粉酶活力測定方法：稱取10 g 麩曲置于250 mL 燒杯中，加入180 mL 蒸餾水和20 mL 的pH5.5 磷酸緩沖液，攪拌均勻，35 ℃水浴鍋中浸提1 h，濾紙過濾。取9 mL 1.0%淀粉緩沖液（50 ℃，預熱5 min）→加1 mL酶液（立即計時，50 ℃恒溫水浴準確反應30 min）→迅速吸取0.5 mL 反應液于裝有1.5 mL DNS 溶液中（采用25 mL 具塞比色管）→煮沸15 min，冷卻，加10.5 mL 蒸餾水（搖勻）在550 nm波長比色。

蛋白酶活力測定方法：按照SB/T 10317—1999方法進行測定。

脂肪酶活力測定方法：按照GB/T 23535—2009方法進行測定。

1.2.6 耐高溫菌株的篩選

將活化后的細菌，劃線接種于營養瓊脂平板上，分別置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養48 h，觀察細菌生長情況。

將活化后的酵母菌，劃線接種于麥芽汁瓊脂平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養48 h，觀察酵母菌生長情況。

將活化后的霉菌，三點接種法接種于察氏培養基平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養5～7 d，觀察霉菌生長情況。

1.2.7 耐酸菌株的篩選

分別用pH3.0、pH4.0 和pH5.0 緩沖液代替細菌、酵母菌和霉菌液體種子培養基中的蒸餾水，制成pH3、pH4、pH5、pH 自然的細菌、酵母菌、霉菌液體培養基。

將細菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的細菌液體培養基中，以35℃、180 r/min 搖床培養48 h；將酵母菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的酵母菌液體培養基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養48 h；將霉菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的霉菌液體培養基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養7 d。

生長量測定：細菌、酵母菌不同pH 值下生長量測定采用比濁法，以各自對應pH 值的空白培養基為對照，在波長600 nm 下用比色管測定培養液的吸光度值OD600；霉菌不同pH 值下生長量測定采用稱干重法：將培養液用濾紙過濾，少量水洗滌，烘箱80 ℃下烘干，稱菌絲干重。

2 結果與分析

2.1 扳倒井釀酒微生物的分離篩選及鑒定結果

通過分離和多次分純對比，結合菌落外觀和鏡檢觀察，從扳倒井大曲、酒醅及窖泥中初步分離得到61 株細菌、19 株酵母菌和32 株霉菌，其中83 株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

細菌主要為地衣芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、普通高溫放線菌、枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、淤泥大洋芽孢桿菌、韓國芽孢八疊球菌、沙福芽孢桿菌、泛菌屬、短桿菌屬等；酵母菌主要為扣囊復膜孢酵母、異常威克漢姆酵母、伯頓絲孢畢赤酵母、庫德畢赤酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、奇異釀酒酵母；霉菌主要為謝瓦散囊菌、黑曲霉、米根霉、繩狀青霉、產黃青霉、金灰青霉、煙曲霉、溜曲霉、聚多曲霉、宛氏擬青霉、泡盛曲霉、雪白絲衣霉等。

2.2 高酶活菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至麩皮固體培養基中，培養結束后40 ℃烘干，分別測定其蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，結果見表1—表4。

2.3 耐高溫菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至平板上，分別置于不同溫度下靜置培養，篩選出耐高溫（55 ℃）菌株15株，結果見表5。

2.4 耐酸菌株的篩選

將112 株菌種分別接種至不同pH 值的液體培養基中，培養結束后測定其生長量，篩選出1 株耐酸（pH3）細菌琥珀葡萄球菌（保藏編號BDJ20103），其余19株酵母菌和32株霉菌均耐pH3.0。

3 結論

本試驗利用梯度稀釋法和劃線純化法，對扳倒井大曲、酒醅及窖泥中的微生物進行全面的分離純化，共得到112 株菌種，包括61 株細菌、19 株酵母菌和32株霉菌，其中83株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

表1 高產中性蛋白酶菌株篩選結果

表2 高產脂肪酶菌株篩選結果

通過形態觀察和16S rDNA、ITS 及BT 序列測定，對112 株菌種進行鑒定。并對其進行凍干管制作，保藏至扳倒井微生物菌種資源庫。

對112 株菌種麩皮培養物的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力進行測定，篩選出高產淀粉酶菌株21株、高產中性蛋白酶菌株16 株、高產酸性蛋白酶菌株6株、高產脂肪酶菌株20株。

對112 株菌種在不同溫度下的生長情況進行測定，篩選出耐55 ℃的菌株15株。

表4 高產酸性蛋白酶菌株篩選結果

表5 耐高溫(55 ℃)菌株篩選結果

對112 株菌種在不同pH 值液體培養基中的生長情況進行測定，篩選出耐pH3 的細菌1 株、酵母菌19株、霉菌32株。

在后續試驗中，將進行耐稀氧、耐酒精等抗逆性能的篩選；并進一步對篩選出的菌株進行單菌株和復合菌株的小型發酵試驗，以篩選出適合大曲生產和白酒釀造的優良功能微生物菌株和復合菌劑。