消除國產瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝優化及設計

段博嚴，倪輝，2，3，李志朋，2，3，姜澤東，2，3，朱艷冰，2，3，李清彪，2，3

（1 集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3 廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

瓊脂是從江蘺 （）、 石花菜（）、龍須菜（）等海洋紅藻中提取膠質制成的一種長鏈形親水多糖膠體，具備良好的膠凝能力、凝膠可逆性和高滯后性等性質，在食品工業、生物醫藥、日用化工等領域都有廣泛應用。

目前，大部分瓊脂產品都已經實現了國產化，但微生物培養基專用瓊脂等產品尚未實現國產化生產。相關研究表明，配置微生物培養的生化瓊脂要求良好的透明度，而國產瓊脂配置微生物培養基時，加入磷酸鹽后常出現渾濁或沉淀現象，導致透明度降低，影響微生物群落觀察及計數。部分學者認為國產瓊脂中存在鈣、鎂離子，在培養基配置時與磷酸鹽反應生成不溶性沉淀，引起培養基渾濁度增加、透明度降低的“磷酸鹽沉淀”現象。目前，常用去除鈣、鎂離子的方法有吸附法（adsorption method）、 化學沉淀法（chemical precipitation method）， 掩蔽劑法（screening reagent softening）、離子交換法（ion exchange process）、膜分離法（separation membrane）以及電滲析法（electrodialysis）等。黎新等研究發現分步沉淀法可有效去除鈣離子，而鎂離子無明顯變化。Dong等研究發現產堿桿菌可通過胺化反應生成碳酸鹽，從而去除海水中鈣、鎂離子。Sepehr 等研究發現改性沸石吸附法去除水中鈣、鎂離子。陳志林等發現在氯堿工業中以加入磷酸鹽沉降鈣、鎂離子，可以顯著去除鈣、鎂離子。王萍萍研究發現陽離子交換樹脂可以顯著降低瓊脂中灰分含量。此外，相關研究還表明，在瓊脂制備過程中采用烷基化法、羧烷基化法和縮水甘油醚法等改性處理也可以改善瓊脂產品透明度。雖然研究人員對瓊脂磷酸鹽沉淀已經進行了一些研究，但國產瓊脂產生磷酸鹽沉淀的原因尚不完全明確，相關技術尚不能完全消除磷酸鹽沉淀，國產瓊脂磷酸鹽沉淀問題尚未解決，導致微生物學計數用的生化瓊脂大量依賴進口。

基于以上背景，本文根據相關研究報道，以Sigma 瓊脂、國產瓊脂條和國產瓊脂粉為原料，以瓊脂溶液添加磷酸鹽后的透明度和濁度為評價指標，研究吸附法、掩蔽劑法和沉淀過濾法等對消除瓊脂磷酸鹽沉淀的效果，從瓊脂原料和處理方法兩個方面闡明生產生化瓊脂的關鍵技術，并通過工藝設計評估該技術的經濟可行性，為國產化制備高品質微生物培養基瓊脂提供工藝方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產瓊脂條和國產瓊脂粉，綠新（福建）食品有限公司；Sigma-A6686瓊脂粉，Sigma有限公司；活性沸石，青島鵬潤沸石礦物有限公司；3～5mm活性氧化鋁球，龍鑫凈水有限公司；AR 磷酸氫二鉀、AR 氯化氫、AR 氯化鈉、AR 氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；AR 乙二胺四乙酸（EDTA），上海恒信化學試劑有限公司。

PL602-S電子天平、FE20pH計，梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；ZXRB-B5210鼓風干燥箱、ZSBB-728 恒溫水浴鍋，廈門史維思技術服務有限公司；NN-GT353M 微波爐，松下電器（中國）有限公司；BXU-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司；WGZ-2000濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；V-T3 可見分光光度計，屹譜儀器制造（上海）有限公司；LXJ-IIB 離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸鹽沉淀程度的測定

以料液比（質量比）1.5∶100 分別稱取Sigma瓊脂、國產瓊脂粉和國產瓊脂條1.5g，加入100mL去離子水后進行加熱，充分攪拌溶解，制成瓊脂樣液，加入0.500g 磷酸氫二鉀并用磷酸溶液調節pH至7.0～7.5，121℃高壓滅菌20min，進行透明度和濁度測定。其中，透明度測定是將質量分數為1.5%的瓊脂溶液趁熱倒入比色皿中，室溫放置24h，用紫外可見分光光度計測定750nm的透光率；濁度的測定是取適量樣品溶液，冷卻至85℃，倒入準備好的測試瓶中至刻度線位置，用濁度儀測定瓊脂溶膠的濁度（NTU）。

1.2.2 活性沸石吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

根據相關文獻[23]，以1mol/L NaCl+1mol/L NaOH 活化沸石，提高其吸附性能。稱取1.5g 瓊脂樣品，加入100mL 去離子水，在100℃溫度條件下水浴保溫20min后，溶解后加入預熱至60℃的活性沸石2g，80℃水浴振蕩5min 后過濾，得到活性沸石處理后的樣液。向處理后樣液中加入0.500g磷酸氫二鉀攪拌均勻，經121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.3 活性氧化鋁吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

將活性氧化鋁用蒸餾水反復清洗至洗液透明，并浸泡20h 以上，熱風干燥12h 后放于干燥器內保存。稱取1.5g 瓊脂樣品，加入100mL 去離子水，在100℃溫度條件下水浴加熱20min 后，加入提前預熱至60℃的活性氧化鋁2g，在80℃溫度條件下水浴振蕩5min 后過濾，得到處理樣液。向處理后樣液中加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.4 EDTA掩蔽劑法去除瓊脂磷酸鹽沉淀的作用

稱取1.5g瓊脂樣品，加入100mL去離子水，在100℃水浴中加熱20min 后加入0.020g EDTA，100℃水浴30min，取出靜置至完全凝固，用尼龍布包裹后壓榨脫水，用20倍體積清水浸泡潤洗3次，再次脫水后加水至總體積100mL，100℃加熱熔化后加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.5 磷酸氫二鉀沉淀法去除瓊脂磷酸鹽沉淀的作用

稱取1.5g瓊脂樣品，加入100mL去離子水，在100℃水浴中加熱20min 后加入0.500g 磷酸氫二鉀在100℃下攪拌5min，靜置10min 進行預沉淀。然后過濾得到處理樣液，待靜置凝固后用尼龍布包裹壓榨脫水，用20倍體積清水浸泡潤洗3次，總體積100mL，100℃加熱熔化后加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經121℃高壓滅菌20min后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.6 數據分析方法

實驗采用3 次平行實驗，平均值為實驗數據。利用Microsoft Office Excel 2019 軟件進行平均值、標準偏差的計算。利用AutoCAD 2020 軟件進行工藝流程圖設計。

2 分析與討論

2.1 活性沸石吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

活性沸石由于獨特的微孔晶體結構及高比表面積，對多種金屬離子具有最大吸附能力?；钚苑惺瘜a和Mg的吸附涉及兩種基本機制：一種是用溶解的Ca和Mg替換游離沸石離子（Na）或部分結構離子，為表面絡合過程；另一種是在離子交換作用減小后的靜電吸引、化學結合和化學絡合過程，為內部絡合過程。研究表明，使用活性沸石對水中鈣、鎂離子去除率可達到70%和60%。根據相關報道，活性沸石吸附Ca和Mg的功能可能去除瓊脂磷酸鹽沉淀，但目前有關活性沸石處理對瓊脂中磷酸鹽沉淀影響的研究尚未報道。圖1 顯示，在未處理條件下，Sigma 瓊脂的透明度明顯高于國產瓊脂條和國產瓊脂粉；濁度顯著低于國產瓊脂條和國產瓊脂粉，該結果說明國產瓊脂條和瓊脂粉的磷酸鹽沉淀程度要高于Sigma瓊脂。經過活性沸石處理后，Sigma 瓊脂、國產瓊脂條和國產瓊脂粉的透明度都有所降低，Sigma 瓊脂的濁度沒有明顯變化，國產瓊脂條和國產瓊脂粉的濁度有所降低。參照日本對生化瓊脂中濁度應小于20NUT 的標準，活性沸石吸附法處理瓊脂達不到生化瓊脂的質量水平，也達不到Sigma 普通瓊脂的質量水平。該結果說明活性沸石吸附法雖然對國產瓊脂條和瓊脂粉具有一定的降低濁度作用，但不能消除瓊脂的磷酸鹽沉淀。該現象的原因可能是瓊脂中引起磷酸鹽沉淀的成分除鈣、鎂離子外，還有其他成分；此外，瓊脂溶液具有一定黏度，降低了沸石對鈣、鎂離子的吸附效果，這可能是另外一個原因。

圖1 活性沸石處理對樣液濁度及透明度的影響

2.2 活性氧化鋁吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

活性氧化鋁特殊的尖晶石結構使其具有高比表面積、高機械強度和良好的吸附性能?；钚匝趸X對Ca和Mg吸附的基本機制包括靜電吸引和離子交換，其中靜電吸引適用于堿性環境，有利于吸附劑表面羥基的去質子化，這導致吸附劑表面呈負電性并通過靜電引力將帶正電的鈣、鎂離子吸附到帶負電的吸附劑表面上；離子交換則是附著在吸附劑表面的游離離子（Na）有利于與鈣、鎂離子進行離子交換。有研究表明，活性氧化鋁對水中鈣、 鎂離子去除率可達75.6% 和44.16%。Lorenzen 等研究表明，在pH 小于等于8.0，操作溫度小于45℃時，活性氧化鋁的吸附效果最佳。根據活性氧化鋁吸附Ca和Mg的功能，推測其可能具有降低瓊脂磷酸鹽沉淀的作用，但目前有關活性氧化鋁處理對瓊脂中磷酸鹽沉淀影響的研究尚未報道。圖2 顯示，經過活性氧化鋁處理后，Sigma 瓊脂、國產瓊脂條和國產瓊脂粉的透明度都比未處理有所降低，而Sigma瓊脂的濁度沒有明顯變化，國產瓊脂條和國產瓊脂粉的濁度顯著降低；該規律與圖3所示的活性沸石處理后濁度和透明度變化規律相似，說明活性氧化鋁吸附法不能有效降低瓊脂磷酸鹽沉淀。該現象的原因可能是瓊脂中引起磷酸鹽沉淀的成分復雜以及瓊脂溶液的黏度影響了活性氧化鋁對鈣、鎂離子的吸附效果。

圖2 活性氧化鋁處理對樣液濁度及透明度的影響

圖3 EDTA處理對樣液濁度及透明度的影響

2.3 EDTA 掩蔽劑法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

EDTA 作為一種氨基多元羧酸螯合劑擁有6 個配位點，分別位于2個氮原子及4個羧基上的氧原子，因此能較好地與大多數金屬元素形成穩定的水溶性配合物。EDTA 去除Ca和Mg的機理可以概括為絡合反應機理，如式(1)、式(2)所示。

加入EDTA 與瓊脂溶液充分混合后，EDTA 與鈣、鎂離子發生絡合反應生成可溶于水的鈣、鎂絡合物，通過脫水將鈣、鎂絡合物與瓊脂溶液分離，進而達到去除瓊脂中鈣、鎂離子的目的。如圖3所示，經過EDTA 處理后瓊脂樣品的濁度顯著降低，透明度顯著提高（均大于等于94.7%）。該結果說明EDTA掩蔽劑法可有效降低瓊脂磷酸鹽沉淀的程度，這可能與其螯合瓊脂溶液中多價金屬離子的能力有關。經過EDTA 處理后，Sigma 瓊脂、國產瓊脂條及國產瓊脂粉的濁度分別降低至53.61NTU、50.63NTU 和48.03NTU，參照日本對生化瓊脂中濁度應小于20NUT的標準，仍然達不到生化瓊脂的濁度標準要求；這說明EDTA掩蔽法處理可以顯著降低瓊脂磷酸鹽沉淀，但尚達不到消除瓊脂磷酸鹽沉淀的效果。

2.4 磷酸氫二鉀化學沉淀法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

磷酸氫二鉀易溶于水，水溶液呈弱堿性，其去除Ca和Mg的機理可以概括為化學沉淀反應機理，如式(3)～式(5)所示。

磷酸氫二鉀與Ca及Mg發生化學反應，生成磷酸鈣、磷酸氫鈣及磷酸氫鎂沉淀，從而去除鈣、鎂兩種元素。如圖4所示，經過磷酸氫二鉀處理后，Sigma 瓊脂、國產瓊脂條及國產瓊脂粉的濁度相比未處理都顯著降低，透明度也都明顯提高（均大于等于92.0%）。與掩蔽劑法相比，兩種方法處理后透明度都顯著提高；而在降低濁度方面，顯然化學沉淀法優于掩蔽劑法。其中，Sigma 瓊脂和國產瓊脂條經過處理后的濁度分別為13.15NTU 和20.27NTU，參照日本對生化瓊脂中濁度應小于20NTU 的標準，達到了生化瓊脂濁度不高于20NTU 的標準。國產瓊脂粉經過處理后的濁度為43.84NTU，達不到生化瓊脂濁度不高于20NTU 的標準。該結果說明磷酸氫二鉀化學沉淀法處理Sigma 瓊脂和國產瓊脂條，可以制備得到符合生化瓊脂質量要求的瓊脂產品。

圖4 磷酸氫二鉀處理對樣液濁度及透明度的影響

2.5 消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝設計及經濟技術分析

通過以上研究結果，磷酸氫二鉀處理Sigma瓊脂和國產瓊脂條，可以將瓊脂的透明度提高至94%以上，將濁度降低至20NTU，符合生化瓊脂的要求。在此基礎上，根據相關文獻[33]，以國產瓊脂條為原料，對磷酸鹽沉淀法去除瓊脂磷酸鹽沉淀進行工藝設計，評估其工藝的產業化經濟可行性（圖5）。磷酸鹽沉淀法消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝流程是：國產瓊脂→溶膠→磷酸氫二鉀預沉淀→過濾→凝膠→機械脫水→浸洗三次→機械脫水→干燥→粉碎。其中，溶膠是在蒸煮罐中加熱使瓊脂完全溶解，磷酸氫二鉀預沉淀是溶膠后加入磷酸氫二鉀形成沉淀，過濾是使用板框壓濾機使生成的磷酸鹽沉淀與膠液分離，機械脫水是通過壓榨的方式使瓊脂凝膠與磷酸鹽水溶液分離，浸洗是使用純水浸泡壓榨后的瓊脂凝膠使其中的磷酸鹽溶出，多次浸洗再脫水盡可能去除瓊脂凝膠中殘留的磷酸鹽，干燥是將壓榨脫水后的瓊脂凝膠于45～55℃烘干，粉碎是用粉碎機將干燥后的瓊脂粉碎過80 目篩。假設在年產量1000t、每天生產三班、每班為8h制、每班需要1h設備清洗時間、設備不均勻系數取0.75、產品損耗率5%、年工作總天數300 天的條件下，如式(6)所示，班產量計算為1.11t。根據預實驗結果，1t 國產瓊脂條經過處理后可生產0.95t 消除磷酸鹽沉淀的生化瓊脂。根據阿里巴巴平臺價格，國產瓊脂條售價為13萬元/噸，生化瓊脂的市場售價為24 萬元/噸。根據年產量1000t 生化瓊脂的工藝設計，對生產車間投資總費用包括總設備投資及廠房建設投資進行核算（表1），總設備投資費用為53.48 萬元，廠房建設投資費用為150 萬元。設備按10 年折舊，余值5%計算設備折舊費為5.08 萬元，對年生產成本包括水電汽消耗，原材料成本，易耗品成本及其他成本進行核算（表2），計算出年生產成本及年銷售總額分別為14508.75 萬元和24000 萬元。根據年息稅前利潤[式(7)]及年利潤[式(8)]計算投資利潤率[式(9)]和靜態投資回收期[式(10)]分別為64.01%和3.3年，該結果說明本研究消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝具有經濟可行性，產業化前景良好。

圖5 消除磷酸鹽沉淀的工藝流程（單位：mm）

表1 消除瓊脂磷酸鹽沉淀的車間建設總投資成本核算

表2 年產1000t消除磷酸鹽沉淀的瓊脂生產成本核算

3 結論

通過采用不同方法處理Sigma瓊脂、國產瓊脂粉及國產瓊脂條，探索消除瓊脂磷酸鹽沉淀的方法。實驗結果顯示，加入磷酸氫二鉀處理后Sigma瓊脂和國產瓊脂條，可以將瓊脂的透明度提高至94%以上，將濁度降低至20NTU，符合生化瓊脂的要求。工藝設計及經濟成本核算表明，采用磷酸氫二鉀法處理國產瓊脂條消除磷酸鹽沉淀，每處理1t國產瓊脂條可增加收益約9.8 萬元，總投資利潤率為64.01%，靜態投資回收期為3.3年。該研究建立的消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝具有經濟可行性，為國產化微生物培養基所用的生化瓊脂的提供技術參考。