88例骨髓增殖性疾病患者的臨床資料分析

肖 超，陶 英，宋陸茜，趙佑山，吳凌云，常春康

(上海交通大學附屬第六人民醫院血液科，上海 200233)

骨髓增殖性疾病 （myeloproliferative neoplasm，MPN）是一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞不斷克隆性增殖所導致的一組腫瘤性疾病。原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）、真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）和原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）是費城染色體陰性MPN 的主要病種[1]，這3 種疾病患者都可能發生白血病轉化和血栓出血事件，但其臨床表現及預后各不相同。2016 版WHO 髓系腫瘤和急性白血病診斷標準[2]（以下簡稱2016 版WHO 診斷標準）將PMF明確區分為原發性骨髓纖維化前期（prefibrotic primary myelofibrosis，pre-PMF）和明顯的PMF（overt-PMF），而兩者的臨床癥狀和預后均存在明顯不同。

迄今為止，只有少數關于MPN 的流行病學研究，因而本研究調查了我院近期連續診斷的88例MPN 患者（主要是PV、ET、PMF），對其疾病參數進行了初步的分析研究，比較pre-PMF 與ET、pre-PMF 與overt-PMF 患者的診斷標準及臨床參數，從而明確pre-PMF 診斷的臨床價值和重要性，以期為臨床治療選擇提供參考。

資料與方法

一、資料

選取2015 年1 月到2018 年1 月我科連續診斷的88例MPN 病例（參考2016 版WHO 診斷標準），收集這些病例的疾病相關數據進行分析研究，包括年齡、性別、診斷分型、白細胞計數、血紅蛋白水平、血小板計數、乳酸脫氫酶（lactic aciddehydrogenase,LDH）水平、脾腫大情況、骨髓巨核細胞數和Gomori 銀染色、相關基因 （JAK2 V617F、CALR、MPL）突變等。本研究獲得我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

血紅蛋白含量、血小板計數、白細胞計數均由我院血液病實驗室醫師抽取患者外周靜脈血后，經sysmex xs-800i 血細胞分析儀檢測獲得數據。每例患者常規進行腹部超聲檢查，由我院超聲科醫師經日立超聲診斷儀（凸陣探頭，3.5 MHz）測得脾腫大數值。骨髓巨核細胞數和Gomori 銀染色由我院血液病實驗室醫師將取得的骨髓活組織經Bouin 液固定，用乙醇脫水，Hemapun865 劑包埋，隨后切片并染色，使用OLYMPUS CX41 顯微鏡進行病理檢查所得?；蛲蛔儥z測由我院血液科醫師行骨髓穿刺抽取少量骨髓液（部分骨髓干抽的患者使用外周血代替），經患者知情同意，送往“金域醫學檢驗中心”（第三方醫學檢測機構），通過片段分析和測序分別檢測CALR、JAK2 V617F、MPL 的突變情況。

三、統計學處理

數據應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，P＜0.05 時認為有統計學意義。

結果

一、各疾病分型患者的臨床特點（見表1）

88例MPN 患者中男性46例 （52%），女性42例（48%）；中位年齡為61歲（20～88歲），32例（36%）為老年患者（≥65歲）；22例（25%）有脾腫大（1例已行脾切術）。檢出JAK2 V617F 突變者有51例（58%），檢出CALR 突變5例（6%），檢出MPL突變2例（2%），三陰性30例（34%）。使用2016 版WHO 診斷標準進行分類，PV 有20例，ET 有23例，PMF 共45例，其中pre-PMF 為23例 （占PMF 的51%），overt-PMF 為22例（49%）。觀察分析PV、ET、pre-PMF、overt-PMF 患者的臨床特點，發現存在脾腫大例數、白細胞計數增多（＞11×109/L）、血紅蛋白含量降低（＜100 g/L）、血小板計數降低（＜100×109/L）的患者百分比以及LDH 水平、骨髓纖維化程度、骨髓巨核細胞數等都存在組間差異（P＜0.05）（見表1）。

二、基因突變情況及各基因組的臨床特點

觀察PV、ET、pre-PMF、overt-PMF 組間的JAK2 V617F、CALR、MPL 基因突變情況，發現CALR 突變率在4 組間的差異有統計學意義 （P=0.027）（見表1），overt-PMF 組的CALR 突變率高達18%（4/22），其余基因突變率在各組間的差異則無統計學意義。按基因突變情況分組，比較分析各基因組患者的臨床特點，發現CALR 突變患者的中位年齡較小，而其發生血小板計數降低、中重度骨髓纖維化的百分比高于其他基因組（見表2）。

三、pre-PMF 與overt-PMF、ET 患者臨床癥狀及預后比較

pre-PMF 患者相比overt-PMF 患者的臨床癥狀輕，兩者的白細胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數降低的百分比分別為61%比77%（P=0.235）、22%比50%（P=0.048）、4%比27%（P=0.034），pre-PMF 平均LDH 水平較低 （P=0.037）。雖然overt-PMF 組患者的中位年齡略高于pre-PMF 組，overt-PMF 組中老年患者百分比及脾腫大百分比也有略高于pre-PMF 組的趨勢（50%比30%，55%比26%），但差異尚無統計學意義（P 均＞0.05）（見表3）。

pre-PMF 患者與ET 患者的臨床表現相似，發病中位年齡接近，老年患者所占百分比也大致相同，2 組間的平均LDH 水平以及血紅蛋白含量降低、血小板計數降低的百分比差異均無統計學意義（見表3），僅出現脾腫大的百分比和白細胞計數增多的百分比不同，分別是26%比4%（P=0.043）和61%比17%（P=0.007）。然而，對pre-PMF 和ET 患者進行隨訪發現，ET 患者的生存時間長于pre-PMF 患者（見圖1），差異有統計學意義（P=0.038）。

表1 88例患者的臨床特點[n（%），中位數（范圍）]

表2 各基因分組患者的臨床特點[n（%），中位數（范圍）]

表3 pre-PMF 與overt-PMF、ET 患者的臨床特點比較[n（%），中位數（范圍）]

圖1 ET 患者與pre-PMF 患者的生存曲線

將本研究的88例MPN 患者參考2008 版WHO診斷標準[3]進行判斷，有24例符合ET 診斷，而其中有1例，若參考2016 版WHO 診斷標準[2]則可診斷為pre-PMF。分析該例患者，患者為39歲女性，無脾腫大，血常規檢查示白細胞計數8.4×109/L，血紅蛋白78 g/L，血小板計數684×109/L，中性粒細胞計數6.38×109/L；LDH 水平192 U/L；基因突變檢測到三陰性；骨髓巨核系增生，未見粒系、紅系增生，網硬蛋白Gomori 銀染色1 度，生存時間為70個月。因為患者沒有滿足2008 版WHO 的PMF 診斷標準（未達到2 項次要標準），故被診斷為ET，但其符合2016 版WHO 的pre-PMF 診斷標準（至少1 項次要標準），從生存時間僅為70個月來看，該例患者更符合pre-PMF 診斷。

四、PMF 中發生JAK2 突變患者者與三陰性患者比較

分別比較pre-PMF 組及overt-PMF 組中JAK2 V617F 突變陽性和三陰性患者的臨床資料（見表4）。在pre-PMF 組中，三陰性患者與JAK2 V617F 突變者相比，發病中位年齡較?。?0歲比65歲，P=0.03），脾腫大百分比較高（46%比0，P=0.017），但兩者間其他臨床特點（包括性別、白細胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數降低、LDH 均值）差異無統計學意義，提示三陰性pre-PMF 患者的發病年齡較早，且脾腫大癥狀較明顯。在overt-PMF 組中，三陰性患者與JAK2 突變患者相比，臨床特點差異均無統計學意義。

討論

MPN 是由造血干細胞克隆增殖引起的一組異質性疾病，主要的驅動突變基因包括JAK2 V617F、CALR、MPL 基因，其中，PV、ET、PMF（2016 版WHO分類標準分為pre-PMF 和overt-PMF），這些不同疾病分型患者的臨床表現及預后各不相同，臨床治療方法也不盡相同。

一、PV、ET、PMF 患者的基因突變與預后

PV 患者的中位生存期約為14 年，而ET 患者的中位生存期約為20 年；PV 患者20 年內的白血病轉化率＜10%，ET 患者則＜5%。在95%的PV 患者中可發現JAK2 V617F 突變，而在不到60%的ET和PMF 患者中可檢測到JAK2 V617F 突變[4]。本研究發現，PV、ET、pre-PMF 和overt-PMF 患者的JAK2 V617F 突變率分別 為75%（15/20）、61%（14/23）、43%（10/23）、55%（12/22）。有研究 顯示，ET 中的JAK2、CALR、MPL 突變是相互排斥的，其陽性率分別為55%、25%、3%，而約有17%的患者為三陰性[5]。本研究發現，ET 患者中JAK2、CALR、MPL 基因突變及三陰性的比例分別為61%（14/23）、4%（1/23）、9%（2/23）、26%（6/23）。有文獻提示，驅動基因的突變狀態并未顯示對ET 患者生存有影響，但JAK2、MPL 突變與動脈血栓形成高風險有關，而MPL 突變具有較高的纖維化進展風險[5]。本研究中僅發現2例MPL 突變者，均診斷為ET，其骨髓纖維化不明顯，Gomori 銀染色皆為1 度，尚未發生血栓事件。在之后的治療過程中，需嚴密監測患者纖維化的進展情況及血栓預防治療。

表4 PMF 中JAK2 突變患者與三陰性患者的臨床特點比較[n（%），中位數（范圍）]

PMF 以造血干細胞衍生的克隆性骨髓增生、細胞因子表達異常、骨髓纖維化、貧血、脾腫大、髓外造血、全身性癥狀、惡病質、白血病進展和生存期短為特征。國外研究顯示，PMF 患者的中位年齡為66歲，男性占61%，38%的PMF 患者血紅蛋白＜100 g/L，18%的患者血小板計數＜100×109/L，13%的患者白細胞計數＞25×109/L，24%的患者需要紅細胞輸注，21%出現脾臟腫大，29%的患者有全身癥狀，31%的患者有異常核型；其JAK2 基因突變率為61%，MPL 基因突變率為8%，IDH1/IDH2 突變率為4%；低危和高?；颊叩? 年白血病轉化率分別為6%和21%[6]。日本一項研究顯示，PMF 診斷的中位年齡為66歲，中位生存期為47個月，3 年總生存率為59%；感染和急性白血病轉化是其最常見的死亡原因[7]。本研究發現，PMF（將pre-PMF 與overt-PMF 合并） 的JAK2 突變者占49%（22/45），CALR突變者占9%（4/45），無MPL 突變者；男性占56%（25/45），白細胞計數增多（＞11×109/L）、血紅蛋白含量降低（＜100 g/L）、血小板計數降低（＜100×109/L）的百分比分別為69%（31/45）、36%（16/45）、16%（7/45），與國外研究結果相近。

二、pre-PMF 與overt-PMF 的區別

在2016 WHO 診斷標準公布之前，pre-PMF 未被醫學界普遍認為是MPN 的一個獨特亞群，也未被拿來與overt-PMF 對比分析。直到2017 年，有學者強調了將兩者區分為2個單獨亞型的重要性。Grisslinger 等[8]的研究表明，pre-PMF 代表overt-PMF的一個前驅階段，在臨床、血液學和分子表型方面，pre-PMF 相對于overt-PMF，其患者有較長的總體生存期以及無白血病和無纖維化存活期；但與其他研究報道一致，pre-PMF 患者的總生存期明顯短于ET。pre-PMF 患者相對更年輕，而overt-PMF 患者血液學異常更明顯（貧血、白細胞減少、血小板減少、原始細胞計數高），癥狀更多，脾臟明顯腫大，高危分子突變發生頻率更高。因此，2016 版WHO 診斷標準將PMF 明確區分為pre-PMF 和overt-PMF，具有很大的預后評估意義。本研究同樣發現，pre-PMF患者比晚期PMF 患者的臨床癥狀輕，兩者的白細胞增多、血紅蛋白含量降低、血小板計數降低的百分比分別為61%和77%、22%和50%、4%和27%，而晚期PMF 的發病中位年齡高于pre-PMF （65歲比61歲），且老年患者的百分比和發生脾腫大的百分比也高于pre-PMF （50.0%比30.4%，54.5%比26.1%）。這些恰好提示了兩者預后間的差異，也支持將兩者區分的必要性。

有學者發現，相比于overt-PMF，pre-PMF 隊列中女性患者比例占優勢，提示男性患者快速進展到overt-PMF 的可能性更大[8]。本研究也發現MPN 的某些疾病亞型具有性別優勢，PV 中男性占百分比較多（70.0%），而ET 中女性占百分比較多（69.6%），這種現象可能與樣本量小導致的性別偏倚有關，也可能與男性雄激素的促紅細胞生長功能有關，或許提示性別與疾病間的某種其他聯系，需日后擴大樣本量進一步研究。

在pre-PMF 中，三陰性患者比JAK2 V617F 突變者的發病中位年齡小，發生脾腫大的例數多，可能提示三陰性患者的癥狀重、預后差。但在overt-PMF 中，三陰性患者與JAK2 突變患者相比，差異無統計學意義，可能提示三陰性對overt-PMF 的預后影響不大。

三、pre-PMF 與ET 的區別

雖然，pre-PMF 患者與ET 患者的臨床表現極為相似，且存在相同的分子標志及基因突變，但pre-PMF 的預后差，死亡率及白血病轉化率也相對較高，因而，借助形態學上的不同，仔細區分pre-PMF與ET 具有明確的預后意義[9]。有文獻顯示，ET 的骨髓組織病理學標志是，具有成熟細胞質和多分葉狀核的巨形巨核細胞的特征性增生及成簇聚集[10]；而pre-PMF 和overt-PMF 的骨髓組織病理學特點主要是非典型的巨形未成熟巨核細胞伴云狀未成熟核，這在ET 和PV 中很難看到。這種異常的原發性巨核細胞粒細胞化生是巨核細胞和粒細胞異常增生的一種雙重性腫瘤性增殖，是pre-PMF 的早期特征。骨髓的纖維化是絕大多數PMF 患者的顯著特征，但不是ET 的特征，其在pre-PMF 的自然病程中都將或多或少地快速進展。

根據2016 版WHO 的pre-PMF 診斷標準，診斷pre-PMF 至少需要滿足貧血、白細胞增多、乳酸脫氫酶升高和脾腫大這4個標準之一。有研究評估了170例pre-PMF 患者這4個標準出現的相對頻率，并與225例ET 患者進行比較，發現超過91%的pre-PMF 病例顯示出4 種標準中的一種或多種特征，而只有48%的ET 患者有此現象[11]。該研究應用Cox 回歸模型分析次要標準對總體存活的影響，發現只有白細胞增多是pre-PMF 和ET 存活率的重要影響因子。pre-PMF 中的分子特征也顯示了存活差異，CALR 突變的存活優于JAK2 突變，但在ET中未發現這種差異。該研究比較了pre-PMF 與ET患者的不同結局及相關分子遺傳數據，強調了這是2 種不同的疾病概念，而不是相同疾病的連續狀態。因此，細致的組織形態學診斷結合次要臨床標準，可以區分pre-PMF 與ET。本研究中有1例患者根據2008 版WHO 診斷標準被診斷為ET，而根據2016 版WHO 診斷標準則可診斷為pre-PMF。由于pre-PMF 與ET 間的預后存在差異，因而2016 版WHO 診斷標準對區分pre-PMF 與ET 極為重要，對臨床治療的選擇將有極大幫助。

四、基因檢測對骨髓纖維化靶向治療的指導意義

MPN 患者絕大部分最終都會發生骨髓的纖維化，這是一種進展性疾病，而其不斷惡化的消耗性癥狀（包括盜汗、體重減輕、發熱）嚴重影響了患者的生活質量和預后[12-13]，超過80%的骨髓纖維化患者可出現脾臟腫大[14]。JAK-STAT 通路失調是骨髓纖維化疾病的特點[12-15]，JAK 信號通路可激活STAT的轉錄因子，從而控制免疫和造血細胞的分化、生長、增殖及存活[16]。超過90%的骨髓纖維化患者存在JAK2 V617F、CALR 或MPL 基因突變，繼而導致JAK 信號失調，最終導致造血細胞惡性增殖及炎性因子過度釋放[17-18]。JAK 通路抑制劑可以結合JAK1 和JAK2 激酶，調節細胞增殖并減輕脾臟腫大，且這種抑制作用與JAK2 V617F 突變存在與否無關[19]。三陰性患者目前還沒有明確的靶基因，而采用二代測序探索這些患者的其他基因情況（如SETBP1、SRSF2、ASXL1、TET2、EZH2、IDH1/IDH2 等），或許能找到潛在的靶基因，并提供更好的治療辦法。

總之，MPN 是一組異質性克隆性血液系統疾病，PV 和ET 患者的中位生存期長于PMF 患者，而PMF 中的pre-PMF 患者與overt-PMF 患者呈現出不同的臨床表現及預后，因此區分以上這些疾病對臨床治療策略的選擇相當重要，尤其是pre-PMF 與ET、overt-PMF 的鑒別診斷。雖然，pre-PMF患者與ET 患者的臨床表現極為相似，但pre-PMF患者出現一種或多種2016 版WHO 診斷標準提及的表現頻率高于ET，且pre-PMF 形態學具有特征性的原發性巨核細胞粒細胞化生改變，因此，通過組織形態學診斷結合次要臨床標準，可以準確區分pre-PMF 與ET。雖然JAK 通路抑制劑能改善PMF 患者的脾腫大和生活質量，但如果行二代測序找到三陰性患者的潛在靶基因，或許可以找到更好的治療辦法。