以類白血病反應為首發表現的慢性中性粒細胞白血病二例并文獻復習

彭真萍，項喜喜，張蘇江，李佳明

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院檢驗科，上海 201801；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院血液科，上海 200025）

慢性中性粒細胞白血病 （chronic neutrophilic leukemia，CNL） 是一種極罕見的BCR-ABL 融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤 （myeloproliferative neoplasm，MPN），以外周血成熟中性粒細胞持續增多、骨髓中性粒細胞浸潤和肝脾腫大為主要特點?；颊叩呐R床過程以進行性中性粒細胞增多為特征，其向急性髓細胞性白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）轉化的中位時間為21個月。CNL 患者預后不良，生存期短，中位生存期僅為23.5個月，最常見的直接死亡原因為顱內出血和疾病進展，而大多數患者則死于治療相關的并發癥——難治性白細胞增多癥。目前的治療方案尚不統一，羥基脲、α 干擾素、誘導化療等治療雖可緩解患者的癥狀，但在生存期方面無獲益。隨著分子技術和靶向治療的應用，CNL 的診治有望明顯改善。

近年來，隨著CNL 的分子生物學、遺傳學等方面研究的進展，采用基因突變檢測來診斷CNL 已取得了較大的突破。2016 年，世界衛生組織將CSF3R 基因突變列為診斷標準之一，現已發現十幾種CSF3R 基因突變，其中最常見的為CSF3R T618I和CSF3R T615A[1]。但鑒于CNL 的臨床異質性，其診斷仍依賴傳統的排除性標準。CNL 應特別注意與類白血病反應、慢性髓細胞性白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）、不典型慢性髓細胞性白血?。╝typical chronic myelogenous leukemia，aCML）、骨髓纖維化及其他血液腫瘤相鑒別。本研究擬總結2例CNL 患者的臨床資料、骨髓形態學及病理活檢特點，并結合相關文獻進行分析，以進一步提高臨床對該疾病的識別能力。

資料與方法

一、資料

2010 年至2019 年期間，收集上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院門診收治并經病理證實的2例以類白血病反應為首發表現的CNL 患者。

1.例1：患者為男性，38歲，因尿酸升高，且體檢血常規發現白細胞計數增多（18×109/L）就診，而其血紅蛋白含量、血小板計數均正常。結合患者的外周血象及骨髓細胞形態學檢查結果，當時考慮其為類白血病反應。予行骨髓染色體核型分析，結果提示為46，XY；骨髓白血病融合基因篩查示，JAK2 V617F（-）、BCR-ABL（-），未檢測到常見的29 種白血病融合基因轉錄本；骨髓活檢結果考慮類白血病反應可能。17個月后，患者復查骨髓形態學檢查，結果顯示感染或類白血病反應不排除。隨訪血常規檢查，白細胞計數最高達36×109/L，遂予患者羥基脲、青黃散、中藥及干擾素等治療。后患者因血小板和血紅蛋白降低，故自行停藥。初次就診4 年后，患者行CSF3R 突變檢測，結果為陽性（T618I），被確診為CNL。初次就診6 年后，患者開始接受Janus 激酶（Janus kinase，JAK）抑制劑蘆可替尼口服治療，治療約4個月，患者出現背部及左肋部疼痛；治療約9個月后，患者行胸椎MRI 檢查，結果顯示胸9 椎弓根占位，占位向內側生長壓迫椎管。后患者在全身麻醉下，接受“胸椎弓根腫瘤切除釘棒系統內固定術”，病理活檢報告提示為粒細胞肉瘤。PET-CT 檢查提示脾臟、全身廣泛骨骼浸潤，胸段豎脊肌浸潤[最大標準攝取值（maximum standard uptake value,SUVmax）=14.1]；右側額葉、顳葉浸潤可能（SUVmax=11.5）；右側頸后三角、左側鎖骨上、雙側腋窩、兩側膈腳后淋巴結受侵可能（SUVmax=7.1）（見圖1）。后患者為進一步治療，至上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院就診。我院醫師結合患者的病史及骨髓形態學檢查，診斷其為AML（CNL合并粒細胞肉瘤后轉化），給予蘆可替尼聯合地西他濱聯合IA、IAG 方案化療3 次。

2.例2：患者為男性，58歲，因咳嗽、咳痰、乏力就診，血常規檢查發現白細胞計數明顯增高（40×109/L），2個月后行骨髓穿刺病理學檢查，結果提示類白血病反應可能性大。隨訪期間，患者的白細胞計數維持在（10～20）×109/L。初次就診后2 年，患者雙下肢反復出現片狀瘀斑，呈明顯貧血貌，但無骨痛。體格檢查顯示，患者的肝左葉在劍突下6 cm，邊緣薄，質較硬，脾下緣在臍平線上約3 cm，質地充實。腹部B超顯示其肝脾顯著增大，脾臟大小為165 mm×70 mm。血清單克隆性IgA-λ 增高，血清β2微球蛋白10.40 mg/L，肌酐116 μmol/L。骨髓活檢提示，漿細胞占30%。骨髓流式細胞儀檢查免疫分型顯示，異常細胞占白細胞總數的14%，表達漿細胞抗原，CD117+CD38+CD138+CD56+λ+。該病例經上海市血液學疑難疾病委員會專家會診后診斷為CNL合并多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM），支持依據為以下2 點。①患者行JAK2 及BCR-ABL 基因檢測，結果為陰性，可排除CML；②患者復查的外周血、骨髓象形態學改變及病理活檢結果不同于類白血病反應，且白細胞持續增多2 年、脾大進行性加重，傾向于CNL。隨后給予患者VCD 方案（萬珂+環磷酰胺+地塞米松）化療6個療程。

圖1 PET-CT 圖像提示全身廣泛骨骼浸潤

二、方法

1.外周血涂片和骨髓涂片形態學檢查：將新鮮外周血及骨髓穿刺液涂片進行瑞氏-吉姆薩染色后，在油鏡（×1 000）視野下對外周血片及骨髓涂片進行有核細胞分類計數，骨髓涂片分類計數500個有核細胞，外周血片分類計數200個有核細胞。

2.外周血涂片和骨髓涂片細胞化學染色：對新鮮外周血片進行中性粒細胞堿性磷酸酶（neutrophil alkaline phosphatase，NAP）積分染色，試劑購自珠海貝索生物技術有限公司。在油鏡視野下計數100個成熟中性粒細胞，分別將其按照 （-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）的分級情況，計數為0、1、2、3、4 分，統計100個中性粒細胞中陽性細胞的積分之和為積分值。對新鮮骨髓片行過氧化物酶（peroxidase，POX）（魏希本法）染色，在油鏡視野下計數100個原始細胞，并計數陽性百分比。細胞內出現棕黃或藍黑色顆粒沉淀物質為陽性，染色反應程度劃分如下。顆粒細小、散在稀疏分布的小顆粒為（+/-）；顆粒較粗、局灶分布為（+）；顆粒粗大、較密集，占細胞質面積的（1/2）～（2/3）為（++）；顆粒粗大、團塊分布，布滿細胞質為（+++）；細胞質內充滿團塊染色并覆蓋細胞核為（++++）。

3.病理學檢查： 活檢組織標本均經4%甲醛溶液固定，常規脫水后用石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色和免疫組織化學（免疫組化）染色，在光學顯微鏡下觀察。同時連續切片行免疫組化檢測，所用一抗為MPO、CD43、CD117、TDT、CD19、CD20、CD22、CD79α、Ki-67、Bcl-2、Bcl-6、CD5、CD10、CD3、CylinD1、CD56、CD23、CD25、CD21、CD15、Mum-1、ALK1、PAX-5、CD30、S-100、EMA、CKpan、CD138 及CD38 等。所用試劑購自基因科技（上海）有限公司。

4.骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）/MPN 相關基因檢測：取患者初診和復診時骨髓液，樣品送至上海睿昂生物技術有限公司完成DNA 測序分析。檢測基因包括CSF3R、ASXL1、SETBP1、JAK2、CALR、SF3B1、2SRSF2、U2AF1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、TP53、SF3B、RUNX1、NRAS、EZH2、CBL、ETV6 等。

結果

一、外周血及骨髓形態學特征

1.外周血形態特征：例1 患者外周血片成熟中性粒細胞占91%，且可見顆粒增多、增粗現象（見圖2）。初診后約7 年，患者復查外周血單核細胞持續高于1×109/L，且中性粒細胞可見顆粒增多、增粗現象（見圖3），NAP 積分明顯增高，為248 分。例2 患者的外周血白細胞總數增高，外周血成熟中性粒細胞占90%（其中中性桿狀核粒細胞占4%、中性分葉核粒細胞占86%），NAP 積分明顯增高，為300 分。

2.骨髓象形態學特點：例1 患者的初診骨髓象考慮為類白血病反應，可見骨髓有核細胞增生明顯活躍，粒系細胞增生顯著（占84.4%），中幼粒細胞增生為主，中性粒細胞可見顆粒增多、增粗現象（見圖4）?；颊甙l生CNL 轉化為AML 后，骨髓形態學檢查提示，骨髓有核細胞增生活躍，原始細胞占15%，幼單細胞占8%，粒系占50%，以成熟中性粒細胞為主，大部分粒細胞可見顆粒增多、增粗現象。該類原始細胞POX 染色結果為 （-）63%，（+/-）19%，（+）13%，（++）5%（見圖5、6）。

例2 患者的骨髓象特點為，骨髓增生極度活躍，粒細胞增生顯著活躍，中幼粒、晚幼粒細胞占26%，成熟階段粒細胞占26%，中性粒細胞可見顆粒增粗現象；漿細胞占30%（見圖7）。

圖2 CNL 外周血片特征（例1）（瑞氏染色，×1 000）

圖5 CNL 向AML 轉化的骨髓涂片特征（例1）（瑞氏染色，×1 000）

二、病理學檢查

圖6 CNL 轉化為AML 骨髓涂片特征（例1）（POX染色，×1 000）

圖7 CNL 合并MM 時骨髓涂片特征（例2）（瑞氏染色，×1000）

1.例1：例1 患者初診后約6 年的骨髓活檢病理顯示，符合CNL（見圖8），提示造血與脂肪組織之比為9∶1，粒細胞與紅細胞比為20∶1，粒系明顯增生（+++），幼稚前體細胞異常定位+或-，紅系增生減低，巨幼變細胞-，巨核細胞正常，小圓巨核細胞-，裸核型巨核細胞-，網狀細胞-，馬松（Masson）三色染色顯示膠原纖維-；淋巴細胞百分比為2%?；颊叩腃NL 胸9 椎弓（占位）切除標本經病理學結合免疫組化檢查，結果提示為粒細胞肉瘤，結合其他臨床特征，符合CNL 侵犯胸9 椎弓（見圖9）。免疫組化標志物檢測結果為，腫瘤細胞MPO （3+），CD43（2+），CD3（-），CD5（-），CD20（-），PAX-5（-），CD79α（-），CD30（-），ALK1（-），CD15（-），Mum-1（-），Bcl-6（-），CD10（-），c-myc（-），TDT（-），S-100（-），EMA（-），CKpan（-），CD117（-），PLAP（-），Ki-67 約80%（+）?；颊叩腅B 病毒編碼RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）原位雜交結果提示陰性。

2.例2：例2 患者的骨髓活檢病理片顯示，造血組織極度增生，漿細胞百分比增多（20%～30%），并成簇分布，可見大量中性粒細胞增生，原始細胞很少（見圖10）。

三、基因檢測及染色體分析

圖8 CNL 骨髓活檢病理圖片（例1）（HE 染色）

圖9 CNL 轉化為AML 患者的椎弓活檢病理圖片（例1）（HE 染色）

圖10 CNL 合并MM 骨髓活檢病理圖片（例2）（HE 染色）

例1 患者診斷為CNL 時，其骨髓MDS/MPN 相關基因突變檢測提示CSF3R T618I [變異等位基因頻 率 （variant allele frequency,VAF） 83.76%] 和W818X 突變 （VAF 82.87%）、ASXL1 E657fs 突 變（VAF 22.71%）、RUNX1 R204Q 突變（VAF 3.97%）。當其轉化為AML 時，骨髓基因突變檢查結果則提示，CSF3R T618I （VAF 90.81%） 和W818X 突變（VAF 83.77% ）、ASXL1 E657fs 突變 （VAF 8%）、RUNX1 R204Q 突變（VAF 41.38%）?；颊叩淖倒顧z組織經檢測發現CSF3R T618I （VAF 92.91%）和W818X 突變 （VAF 92.91%）、ASXL1 E657fs 突變（VAF 11.05%）、RUNX1 R204Q 突變（VAF 43.49%）（見表1）。

例1 患者由CNL 轉化為AML 時，骨髓與椎弓活檢組織基因突變結果基本一致。在CNL 向AML轉化過程中，RUNX1 R204Q 突變VAF 明顯增高，ASXL1 E657fs 突變VAF 降低。例1 患者診斷為CNL 時，其對蘆可替尼治療有反應，血象及脾腫大明顯改善；而當其轉化為AML 時，則對蘆可替尼及地西他濱治療無效，血象及脾腫大均惡化。

例1 患者骨髓染色體核型分析提示，患者為48，XY，+8，+10，+21[CP2]/46,XY。

例2 患者的骨髓染色體核型正常，熒光原位雜交檢測提示存在1q21 擴增。

四、隨訪結果

例1 患者CNL 轉化為AML 后，予地西他濱聯合急性白血病標準方案誘導化療，骨髓提示未緩解，最終患者死于腦出血。例2 患者診斷為CNL 合并MM,予萬珂為主方案化療后，MM 完全緩解，CNL完全緩解；后用沙利度胺維持2 年，隨訪至2019 年9 月，患者存活。

討論

一、臨床表現

CNL 是一種罕見的CML，該病患者的外周血及骨髓細胞形態學具有不同于其他MPN 的增生特征，其發病較隱匿，具有高度的臨床異質性。多數CNL 患者在就診時無明顯癥狀，或因脾腫大、腹脹就診，或僅體檢出現外周血白細胞計數增高?；颊叩闹饕Y狀包括乏力、食欲減退、盜汗、骨痛、紫癜和體質量減輕等。CNL 診斷時，患者的中位年齡為66.5歲（15～86歲），男性占56%～57%[1]，其臨床過程表現為慢性期、加速期以及急變期。由于目前對于CNL 缺乏大宗的流行病學研究，關于該病的病因及腫瘤起源尚不清楚。

有學者認為，MM 和CNL 共同起源于異常的造血干細胞，其具有分化為髓系和淋巴系的潛能。CNL 中粒細胞的異?？寺⌒栽鲋晨赡芷鹪从诒人柘底婕毎只缙诘碾A段，而有些骨髓瘤細胞表面同時表達單核細胞和漿細胞抗原，因此認為二者可能由一個細胞系分化而來[2]。20%以上的CNL 患者伴有其他腫瘤性疾病，多為MM，粒細胞肉瘤罕見。本研究中例2 患者被診斷為CNL 合并MM。此類病例在國內外已有多例個案報道[3]。本研究報道了1例CNL 合并粒細胞肉瘤患者，國內尚未見類似報道，而CNL 與粒細胞肉瘤的細胞起源還需進一步研究。

表1 例1 基因突變分析

二、骨髓、外周血細胞形態學和骨髓組織病理學特征

CNL 典型的形態學表現是外周白細胞持續增多（≥25×109/L），持續時間一般大于3個月，外周血片中性分葉核和桿狀核粒細胞占白細胞的百分比≥80%，幼粒細胞＜10%,原始細胞罕見，單核細胞計數＜1×109/L，除粒細胞出現明顯顆粒增多、增粗外，一般無病態改變。NAP 積分明顯升高。骨髓增生明顯或極度活躍，中性粒細胞比例明顯增高，細胞成熟正常；原始粒細胞＜5%。骨髓活檢病理顯示，粒細胞/紅細胞比值明顯增高，大量中性粒細胞增生，原始細胞很少。

三、分子學特征

近年分子生物學的研究進展為診斷CNL 提供了重要依據，在2016 年WHO 修訂版髓系腫瘤診斷標準中，CSF3R 基因突變被納為CNL 的診斷標準[4]，這也是CNL 與其他MPN 相鑒別的關鍵點。2013 年Maxson 等[5]發現了CSF3R 基因突變在CNL中的高發生率及特異性，并被其他多個研究證實[6-7]。除了常見的CSF3R 突變，SETBP1、ASXL1、SRSF2、RUNX1、TET2 等基因突變常與CSF3R 突變共同出現，并有學者發現CNL 病例檢測到JAK2 V617F 基因突變[8]，其突變頻率與其他MPN 相似。在回顧已報道的CSF3R 突變的CNL 病例中，SETBP1 和ASXL1 突變率相對較高[9-10]。CNL 中的SETBP1、ASXL1 突變都與預后不良相關[11-12]，而aCML 患者與SETBP1 及ETNK1 基因突變相關[13]。本研究中病例1 出現了CSF3R、ASXL1 及RUNX1突變，并在CNL 轉化為AML 時，其RUNX1 基因突變頻率明顯升高。

四、診斷及鑒別診斷

CNL 需與以下疾病鑒別。

1.類白血病反應：類白血病反應是機體受某些疾病或外界因素刺激后所產生的類似白血病的血象反應，其中中性粒細胞型最常見，患者的白細胞總數可達50×109/L，可出現幼粒細胞甚至原始細胞；骨髓增生明顯或極度活躍，以中性粒細胞增生為主；外周血片和骨髓片的中性粒細胞均出現核左移，顆粒增多和（或）增粗、杜勒小體、退行性變及空泡等毒性改變，但患者無肝脾腫大。原發疾病經治療后，患者的外周血白細胞恢復正常。

2.CML：CML 患者的白細胞總數明顯增高，脾臟腫大甚至巨脾；其外周血片和骨髓片中嗜酸、嗜堿性粒細胞比例增高，NAP 積分明顯降低甚至為0 分；骨髓片中粒、紅二系病態輕微，巨核細胞體積較正常偏小，稱“侏儒巨”，部分可見假戈謝及海藍組織細胞。CML 患者費城（Ph）染色體陽性，BCRABL 融合基因檢查陽性。

3.aCML：CNL 和aCML 患者均無Ph 染色體及BCR-ABL 融合基因。兩者臨床血象特征有時很難鑒別，但aCML 外周血可見白細胞持續增高及較多幼粒細胞（幼粒細胞≥10%），其具有獨特的粒系病態改變，可見假性Pelger-Hüet 畸形，染色質濃集、副染色質清晰的情況下仍然分葉不能，同時伴有少顆?，F象，有時病態還可累及紅系、巨核系。

4.中性粒細胞-慢性粒細胞白血病[14]：近年來，已經出現BCR-ABL1 融合基因陽性的CNL 病例，即Ph 染色體陽性的CNL。然而，這種融合基因不同于CML 或Ph 染色體陽性急性淋巴細胞白血病中所見的斷裂點叢區。典型的CML 的斷裂點在MBCR，產生p210 蛋白；而Ph 染色體陽性急性淋巴細胞白血病中見到的斷裂點在m-BCR，產生p190蛋白。Haskovec 等[15]報告的CNL 病例則為μ-BCR，產生p230 蛋白。有學者建議，這些病例應稱為中性粒細胞-慢性粒細胞白血病。

CNL 易與CML、aCML 及中性粒細胞-慢性粒細胞白血病相混淆，應結合患者的骨髓細胞形態學檢查結果、基因及染色體等分子生物學特征進行鑒別診斷，有助于降低誤診率。本研究的2例患者初診時骨髓均提示類白血病反應，但經歷抗感染等治療后，白細胞計數仍高且超聲顯示脾臟呈增大趨勢，例2 肝脾均顯著增大，結合骨髓形態學檢查及CSF3R 基因檢測，診斷為CNL。

五、治療及預后

近年來,關于分子靶向藥物在CNL 中的臨床應用，證實CSF3R T618I 突變陽性的患者對JAK2抑制劑蘆可替尼敏感。本研究中例1 患者口服蘆可替尼，其臨床癥狀及白細胞計數均明顯改善。有報道稱，SETBP1 突變與蘆可替尼耐藥相關[9]；同時，攜帶CSF3R S783fs 截斷突變患者對達沙替尼敏感。CNL 患者預后不佳，其中位生存期約為2 年，尤其攜帶多種基因突變的患者生存率更低，相關的靶向藥治療仍需大規模臨床實驗驗證。

總之，CNL 具有臨床異質性，可與其他血液腫瘤同時存在，并存在向AML 轉化的高風險。以CSF3R 基因突變為特征的分子診斷標準，有助于CNL 的鑒別診斷。然而，對于尋找有效的分子靶向治療仍有待進一步探索。