香煙煙霧提取物對人支氣管上皮細胞中LIGHT及其受體基因表達的影響

陳翠芬，吳東，吳斌

廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江524000

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥為特征，伴隨廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限的異質性疾病，其癥狀為反復發作的喘息、氣促、胸悶和(或)咳嗽[1]。目前，我國的哮喘患者約3 000萬，而全球約有3億哮喘患者[2]。哮喘致病因素分為內源性和外源性，環境是外源性致病因素中重要的影響因素之一[3]，而香煙煙霧暴露是環境因素中的常見因素。研究表明，哮喘與吸煙有著密切關系[4,5]，吸煙不僅會使哮喘的患病率增加，而且會使其發作次數和病死率增加[6,7]。腫瘤壞死因子超家族成員14(TNFSF14)又稱LIGHT，主要通過與2種細胞受體(LTβR和HVEM)結合而發揮其生物學功能，LIGHT及其信號通路參與了哮喘的慢性氣道炎癥、氣道重塑以及肺纖維化等病理生理過程[8]。目前，香煙煙霧導致哮喘的致病機制尚不十分清楚，且尚未見香煙煙霧對氣道上皮中LIGHT表達影響的相關報道。2019年6～12月，我們以香煙煙霧提取物(CSE)刺激人支氣管上皮細胞16HBE，觀察不同濃度CSE及同一濃度CSE不同作用時間下16HBE細胞中LIGHT、LTβR、HVEM基因表達水平的變化，以探討香煙煙霧對哮喘的影響機制，為哮喘防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料 16HBE細胞(廣州呼吸疾病國家重點實驗室細胞庫)，萬寶路牌香煙(卷煙條碼：6901028143721，購自中國煙草總公司)；胎牛血清(Gibco公司)，DMEM培養基(Gibco公司)，胰酶(Gibco公司)；RNAiso試劑盒(Takara公司)，DEPC水(碧云天)，磷酸鹽緩沖液(Gibco公司)；逆轉錄反應試劑盒(Takara公司)，實時定量PCR反應試劑盒(Takara公司)；無水乙醇、異丙醇、氯仿均為國產分析純。

1.2 CSE制備 點燃1支除去香煙濾嘴的萬寶路牌香煙，接橡膠管；橡膠管一端接真空抽氣泵，利用真空泵的抽吸原理，將燃燒產生的大部分煙霧吸到含100 mL無血清DMEM培養基的瓶中，總共燃燒20支香煙。為使香煙充分燃燒，每支香煙燃燒時間控制在5 min左右。用劇烈震蕩搖晃的方法將香煙煙霧溶解到培養基中，得到咖啡樣的混懸液。用氫氧化鈉液滴定調節pH為7.3～7.4，此為半成品。先后用0.45、0.20 μm濾過孔徑的濾嘴過濾上述半成品，最終得到除菌除渣的成品。此濃度定義為100% CSE原液，CSE原液以無血清DMEM稀釋成1%、2%、3%、4%、5% CSE用于實驗。

1.3 細胞培養與干預處理 將16HBE細胞以1×105/mL接種于6孔板中，每孔2 mL；當細胞融合達80%后分為干預組和對照組，干預組分別加1%、2%、3%、4%、5% CSE培養48 h，或以3% CSE分別培養6、12、24、36、48 h；對照組加同體積的無血清DMEM，每個濃度或每個時間點設3個復孔。

1.4 細胞中LIGHT、LTβR、HVEM mRNA檢測 采用real-time PCR法。收集對照組和干預組不同濃度和不同作用時點的細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA；加入無RNase水溶解RNA，利用分光光度計測定總RNA濃度并計算總RNA體積。按照逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄成cDNA保存，加80 μL DEPC水稀釋cDNA，于-40 ℃冰箱儲存。取逆轉錄反應產物2.0 μL為模板，并以GAPDH為內參，用LIGHT、LTβR、HVEM對應的PCR引物進行熒光定量PCR擴增。引物序列：LIGHT上游引物為5′-ATACAAGAGCGAAGGTCTCACG-3′，下游引物為5′-CTGAGTCTCCCATAACAGCGG-3′；LTβR上游引物為5′-AAGGTCTGGTGGAGGCAGCTC-3′，下游引物為5′-CTCTTGAGCAGCGATCCTGACATC-3′；HVEM上游引物為5′-GCAGTCCAGGTTATCGTGTGAAGG-3′，下游引物為5′-ACACTTGCTTAGGCCATTGAGGTG-3′；GAPDH上游引物為5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，下游引物為5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s, 40個循環。以2-ΔΔCt計算LIGHT、LTβR、HVEM mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度CSE刺激16HBE細胞48 h后LIGHT、LTβR、HVEM mRNA表達變化 與對照組比較，干預組CSE作用16HBE細胞48 h后LIGHT、LTβR mRNA表達升高，分別于3%～5%、2%～5% CSE時差異有統計學意義(P均<0.05)； 干預組以1%～4% CSE作用16HBE細胞48 h后HVEM mRNA表達升高(P均<0.05)，3% CSE時到達峰值，5% CSE時HVEM mRNA表達較對照組降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度CSE刺激16HBE細胞48 h后LIGHT、LTβR、HVEM mRNA表達變化

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 3% CSE作用16HBE細胞不同時點LIGHT、LTβR、HVEM mRNA表達變化 與對照組比較，3% CSE作用16HBE細胞后不同時點LIGHT、LTβR mRNA表達逐漸升高，分別于36、48 h和24、36、48 h時差異有統計學意義(P均<0.05)；3% CSE作用16HBE細胞后48 h時HVEM mRNA表達升高(P<0.01)，其余時點表達變化不顯著。見表2。

表2 3% CSE作用16HBE細胞不同時點LIGHT、LTβR、HVEM mRNA表達變化

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

哮喘是由氣道上皮細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞、平滑肌細胞等多種細胞及細胞組分共同參與的慢性炎癥性氣道疾病。哮喘的危險因素包括職業、環境、氣候變化等，環境因素中香煙煙霧暴露是重要的危險因素之一[1]。香煙煙霧刺激可導致哮喘患者癥狀急性發作，哮喘的發作頻率增加，且病情加重；吸煙哮喘患者不但比非吸煙哮喘患者的癥狀控制更差，且香煙煙霧減弱哮喘患者對糖皮質激素治療的反應性，最終導致肺功能迅速下降而影響生活質量。多項研究表明，吸煙劑量和吸煙年限和哮喘嚴重程度存在劑量-效應關系[9，10]。Tonnesen等[11]研究顯示，哮喘患者戒煙后生活質量明顯得到改善，癥狀和氣道高反應性明顯降低，哮喘用藥量明顯減少。另有研究發現，兒童哮喘發病率、藥物治療的效果不僅與環境中的香煙煙霧有關，還與母親妊娠期的吸煙行為有關[12～15]。因此，只有更明確地了解香煙煙霧對哮喘的致病機制，才能更好地控制此類哮喘患者的病情發展。

LIGHT在1998年被發現后，其在T淋巴細胞活化、自身免疫性疾病方面的作用逐漸被認識；而哮喘也是一種由T淋巴細胞控制炎癥反應的免疫性疾病，因此對LIGHT及其受體在哮喘中的相關研究可能為哮喘的治療提供靶點[16]。氣道高反應性、氣道炎癥和氣道重塑為哮喘的重要病理特征，許多研究表明LIGHT通過引起氣道這三大特征而導致哮喘。肺部炎癥細胞受到過敏原攻擊后分泌LIGHT，而在LIGHT基因敲除大鼠或體外阻斷LIGHT后，哮喘模型大鼠肺纖維化程度、氣道高反應性、平滑肌增生程度均降低[17]。LIGHT與人支氣管上皮細胞的LTβR受體結合，通過刺激IL-8高表達，從而導致氣道慢性炎癥[18]。博來霉素可以促使小鼠表達胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)而導致小鼠肺纖維化，LIGHT基因敲除的小鼠可消除這種作用。研究發現，LIGHT使支氣管上皮細胞分泌TSLP增加，并與IL-13和TGF-β協同促進肺纖維化[19]。有研究表明，人支氣管上皮細胞表達LIGHT的兩種受體LTβR和HVEM, 而對LIGHT起到主要反應的是LTβR[20]。LTβR受體主要與IL-8、ICAM-1和VCAM-1的產生有關，HVEM受體可調控PAR-2表達增加，而這些因子與哮喘的發病息息相關[21～23]。

本研究結果顯示，隨著CSE干預濃度增高及干預時間延長，16HBE細胞中LIGHT、LTβR mRNA表達水平逐漸增高；然而，HVEM mRNA的變化規律與LIGHT、LTβR mRNA并不一致，與相關研究結果一致[20]。其可能原因是LTβR為LIGHT在16HBE細胞主要反應受體，而HVEM可能主要受其他通路的調控[20]。由此可見，隨著香煙煙霧暴露濃度增加和暴露時間的延長，均可以使氣道上皮細胞分泌LIGHT增多；而LIGHT可能通過與其受體結合再引起氣道上皮分泌更多炎癥介質和細胞因子，并引起氣道高反應性及氣道重塑，進一步誘發哮喘的急性發作與加重，并對糖皮質激素治療敏感性下降。但是，香煙煙霧引起支氣管上皮細胞分泌LIGHT增多的具體通路還需要進一步探討。

綜上所述，CSE作用后人支氣管上皮細胞LIGHT及其受體基因表達均發生明顯變化，其可能在吸煙加重哮喘氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑方面發揮了重要作用，但具體的作用機制還需進一步研究。因此，對于主動吸煙或者被動吸煙的哮喘患者，抑制LIGHT基因表達有可能干預哮喘疾病發展，使LIGHT可能成為香煙煙霧暴露哮喘患者的預后判斷指標和潛在治療靶點。