基于CRISPR/Cas9技術構建NPHP1基因敲除的腎集合管上皮細胞

陳華木，孫良忠，胡妙月，林宏容，王海燕，鐘靜琳， 吳小紅

1 中山大學附屬第一醫院，廣州510080；2 中山大學孫逸仙紀念醫院；3 南方醫科大學南方醫院

腎單位腎癆(NPHP)是一種慢性間質性囊腫性腎病，是導致兒童終末期腎臟病(ESRD)最常見的遺傳性疾病[1,2]。NPHP屬于常染色體隱性單基因遺傳病，目前發現的致病基因有20種(NPHP1～20)[3,4]。NPHP1是最常見的致病基因，編碼蛋白nephrocystin-1，主要表達在腎臟遠曲小管和集合管上皮細胞中[5]。在明確致病基因突變的NPHP患者中，NPHP1突變占50%～60%[5～7]；NPHP1突變的主要類型是大片段缺失，少數為點突變或雜合缺失伴點突變[8,9]。目前，NPHP的發病機制尚未十分清楚。CRISPR/Cas9技術是近年開發的簡單高效基因編輯技術，其原理是通過單一引導RNA序列(sgRNA)識別特定靶DNA序列，將內切酶Cas9引導至靶DNA的設定位置進行切割，使DNA雙鏈斷裂，細胞在通過自身非同源性末端修復(NHEJ)時，可使目標區域DNA出現插入、缺失等改變，達到基因敲除或改造的目的[10]。2016年1月～2018年3月，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在體外構建NPHP1基因敲除的犬腎集合管上皮細胞，為深入研究NPHP的發病機制和NPHP1基因的功能提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 犬腎集合管上皮細胞MDCK(余學清教授惠贈)；PX459質粒(Addgene，62988，美國)；Stbl3感受態細胞(全式金，CD521，北京)；無內毒素質粒小提中量試劑盒(天根生化科技有限公司，DP118，北京)；DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318，北京)；質粒PX459測序引物U6-Fwd：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′；兔抗NPHP1多克隆抗體(Sigma,SAB2104055，美國)；鼠抗β-Actin單克隆抗體(CST,3700，美國)；羊抗兔HRP酶標二抗(CST,7074，美國)；馬抗鼠HRP酶標二抗(CST,7076，美國)；反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher，K1622，美國)；實時定量PCR擴增儀(TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，Takara，RR820A，日本)；本研究的引物合成、sgRNA合成和基因測序均由廣州華大基因有限公司完成。

1.2 sgRNA的設計及合成 利用CRISPR在線設計工具(http://crispr.mit.edu)，在犬NPHP1基因(Gene ID：403780)的第5外顯子(SH3功能結構域的起始部分)，設計3對sgRNA(表1)，分別為sgRNA5、sgRNA6、sgRNA7；在sgRNA正義鏈(F)的5′端添加CACC、反義鏈(R)的5′端添加AAAC形成粘性末端，可與BbsⅠ酶酶切后的粘性末端互補。

表1 CRISPR/Cas9 敲除MDCK細胞NPHP1的sgRNA序列

1.3 重組真核表達載體PX459-sgRNA的構建 使用限制性內切酶BbsⅠ酶消化1 μg質粒PX459，使質粒PX459形成線性載體。將sgRNA5～7的F、R在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化和退火形成sgRNA二聚體。將sgRNA二聚體與PX459線性載體在T4 DNA連接酶作用下連接，構建重組真核表達載體PX459-sgRNA。用質粒保護的核酸外切酶去除非特異性連接，并轉化到Stbl3感受態細胞中；將感受態細胞均勻涂到含氨芐青霉素的LB/Amp瓊脂平板培養基上，過夜培養后挑選單菌落；搖菌培養后進行菌液PCR反應(上下游引物分別為U6-Fwd和sgRNA-R)，結果陽性者進行質粒抽提并進行測序驗證及雙酶切鑒定。

1.4 MDCK細胞的培養及質粒轉染 使用DMEM/F12培養基常規培養，在轉染前1 d將生長狀態良好的MDCK細胞以2×104/孔接種于24孔板中；當細胞融合度達70%～90%時，將細胞分為三組進行質粒轉染實驗；陰性對照組不轉染；空載組和轉染組每孔分別轉染空質?；蛑亟M質粒PX459-sgRNA 500 ng+Lipo2000 0.5 μL。轉染8 h后補充無血清DMEM/F12培養基500 μL/孔，放回37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養。

1.5 敲除NPHP1基因MDCK細胞的單克隆篩選 在重組質粒轉染MDCK細胞48 h后，開始加入嘌呤霉素3 μg/mL；每天換液1次，換液時加入嘌呤霉素3 μg/mL；持續5 d或觀察至陰性對照組和空載組均無細胞生長時停止嘌呤霉素篩選，改用DMEM/F12完全培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)培養。待嘌呤霉素篩選后的細胞恢復正常生長時，通過有限稀釋法將細胞接種到96孔板中繼續培養；7～14 d后觀察96孔板，對存在細胞的孔做標記；將里面的細胞轉移到24孔板中，擴大培養后依次轉移到6孔板和細胞培養瓶中。

1.6 敲除NPHP1基因MDCK細胞的基因測序鑒定 使用DNA提取試劑盒對篩選到的細胞分別提取DNA，運用Primer Premier 5軟件對犬NPHP1的第5外顯子區域設計PCR測序引物。NPHP1-5F：5′-AATA-CAGGTCCCATAGTCTCA-3′；NPHP1-5R：5′-ATGCAAAC-TCATCCTTAGGTC-3′。退火溫度為55 ℃，產物大小為582 bp。PCR擴增后，將產物送檢測序。

1.7 敲除NPHP1基因MDCK細胞的脫靶檢測 通過CRISPR在線設計工具(http://crispr.mit.edu)設計sgRNA時，根據網站生成的可能脫靶位點(8個)，在犬基因組中找到對應位置，根據上下游序列設計引物(表2)，通過PCR擴增和Sanger測序分析脫靶情況。

表2 CRISPR/Cas9敲除MDCK細胞NPHP1脫靶位點檢測的上下游引物、退火溫度及產物大小

1.8 通過shRNA敲低NPHP1基因MDCK細胞的構建 針對犬NPHP1的mRNA序列(NM_001195841.1)，設計shRNA干擾位點(5′-CTGCACCCATCGGGAACTATA-3′)與慢病毒載體GV493一起構建重組慢病毒載體，由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。通過慢病毒轉染shRNA進MDCK細胞后，經5 μg/mL嘌呤霉素篩選14 d后，成功構建NPHP1敲低MDCK細胞。

1.9 MDCK細胞中NPHP1 mRNA檢測 采用RT-qPCR法。收集MDCK細胞及CRISPR/Cas9技術敲除NPHP1基因的MDCK細胞，通過TRIzol法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR擴增。引物序列：NPHP1-F：5′-AGCAGGAGGGGAAGAAGT-3′，NPHP1-R：5′-TGGAAGAGTGTGGAAGGC-3′,產物大小為144 bp；GAPDH-F:5′-AAGGTAGTGAAGCAGGCA-3′，GAPDH-R:5′-GGTGGAAGAGTGGGTGTC-3′，產物大小為105 bp。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，擴增40個循環。以GAPDH為內參，根據2-ΔΔCt計算NPHP1的mRNA相對表達量。ΔΔCt=(CT實驗組目的基因-CT實驗組內參)-(CT對照組目的基因-CT對照組內參)。

1.10 MDCK細胞中nephrocystin-1蛋白檢測 采用Western blotting法。收集MDCK細胞及CRISPR/Cas9、shRNA技術敲除(敲低)NPHP1基因的MDCK細胞，PBS緩沖液洗滌3次；RIPA細胞裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑)冰上裂解10 min，超聲破碎儀使蛋白與核酸徹底分離；4 ℃下以12 000 r/min離心15 min去除沉淀，加入5×Loading Buffer在100 ℃下變性15 min;電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；加一抗(NPHP1 1∶1 000，β-Actin 1∶1 000)4 ℃孵育過夜，PBST緩沖液洗膜；二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜；ECL化學發光液曝光顯影，觀察蛋白表達情況。

1.11 MDCK細胞形態觀察 收集MDCK細胞及CRISPR/Cas9、shRNA技術敲除(敲低)NPHP1基因的MDCK細胞，換液時用PBS沖洗2～3次，添加完全培養基，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，同時拍照記錄。

2 結果

2.1 重組真核表達載體PX459-sgRNA構建情況 對含重組真核表達載體的菌液行PCR擴增，均可見清晰條帶(目標產物大小為273 bp)。質粒PX459單酶切后，可見1個線性質粒條帶(大小約10 000 bp)，雙酶切后可見2 個條帶；而重組真核表達載體單酶切均未見線性質粒條帶，雙酶切可見1 個條帶，為線性質粒條帶?；驕y序結果發現，重組真核表達載體相對質粒PX459均插入了一段序列，均與對應sgRNA-F序列一致。以上結果表明，重組真核表達載體構建成功，分別為PX459-sgRNA5、PX459-sgRNA6、PX459-sgRNA7(圖1，見彩插Ⅰ)。

注：A為重組真核表達載體PX459-sgRNA菌液PCR凝膠電泳圖，其中①、②、③表示PX459-sgRNA5，④、⑤、⑥表示PX459-sgRNA6，⑦、⑧、⑨表示PX459-sgRNA7，重組真核表達載體菌液PCR的產物大小為273 bp;B為重組真核表達載體PX459-sgRNA酶切鑒定圖，其中1、2、3、4分別表示質粒PX459和重組真核表達載體PX459-sgRNA5、6、7，每組各3個孔，每組a、b、c分別表示未酶切、單酶切和雙酶切；C～F為質粒PX459與重組真核表達載體PX459-sgRNA的Sanger測序圖，其中C表示質粒PX459，D、E和F分別表示重組載體PX459-sgRNA5、6、7，黑線標記分別為sgRNA5、6、7所在位置。

圖1 重組真核表達載體PX459-sgRNA擴增、酶切鑒定和基因測序驗證結果

2.2 NPHP1基因敲除MDCK細胞的敲除位點Sanger測序結果 Sanger測序結果顯示，同源DNA雙鏈均發生了非3N移碼突變。第一鏈從sgRNA5的第18位點(chr17:-35122766)到sgRNA7的第17位點(chr17:-35122715)之間缺失52個堿基，第二鏈在sgRNA5的第17位點(chr17:-35122767)缺失1個堿基(圖2，見彩插Ⅰ)，分別為c.500_551del(p.His167GlnfsTer14)和c.499delC(p.His167ThrfsTer31)。

注：A：MDCK細胞;B：NPHP1基因敲除MDCK細胞;C：MDCK細胞與NPHP1基因敲除MDCK細胞基因序列比對圖;NPHP1-①和NPHP1-②為NPHP1基因敲除株的雙鏈DNA序列;sgRNA5～7為靶向NPHP1基因第5外顯子的3條sgRNA堿基序列。

圖2 NPHP1基因敲除MDCK細胞的敲除位點Sanger測序結果

2.3 NPHP1基因敲除MDCK細胞的脫靶情況 Sanger測序顯示，NPHP1基因敲除MDCK細胞和MDCK細胞對比，這8個可能脫靶位點的基因序列均一致，未出現插入缺失等基因突變情況，提示上述可能脫靶位點均未出現脫靶情況。

2.4 MDCK細胞NPHP1 mRNA表達情況 RT-qPCR結果顯示，NPHP1基因敲除MDCK細胞NPHP1 mRNA表達量為0.62±0.14，低于MDCK細胞的1.01±0.20(P<0.01)。

2.5 MDCK細胞nephrocystin-1蛋白表達情況 CRISPR/Cas9技術構建的NPHP1基因敲除MDCK細胞nephrocystin-1表達完全消失，通過慢病毒轉染shRNA敲低NPHP1基因MDCK細胞的nephrocystin-1表達減低。見圖3。

注：A、B為MDCK細胞，C、D為CRISPR/Cas9技術敲除NPHP1基因的MDCK細胞，E、F為shRNA敲低NPHP1基因的MDCK細胞，β-actin為內參。

圖3MDCK細胞中nephrocystin-1蛋白表達情況(Western blotting法)

2.6 不同MDCK細胞的細胞形態 MDCK細胞聚集分布，呈鋪路石樣改變。CRISPR/Cas9敲除NPHP1基因的MDCK細胞外形有所改變，與通過慢病毒轉染shRNA敲低NPHP1表達的MDCK細胞外形改變類似，略呈長梭形，細胞間隙稍增大(圖4，見彩插Ⅰ。)

注：A為MDCK細胞，B為shRNA敲低NPHP1基因的MDCK細胞，C為CRISPR/Cas9技術敲除NPHP1基因的MDCK細胞。

圖4 不同MDCK細胞的細胞形態(倒置顯微鏡,400×)

3 討論

NPHP是兒童青少年腎衰竭的主要遺傳性疾病，發病機制目前尚未十分清楚。NPHP1是最主要的致病基因。既往研究主要是通過RNAi技術敲低NPHP1表達來研究NPHP1基因的功能。我們前期對NPHP1表達降低誘導MDCK細胞發生上皮細胞間-充質轉分化及與ZO-1/ZONAB信號通路的關系研究也是采用了RNAi技術[11]。由于RNAi技術存在不徹底性和時限性等缺點，因此，本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術構建NPHP1基因穩定敲除的MDCK細胞模型，將有利于NPHP發病機制的體外研究。

CRISPR/Cas9技術是近年來發展較快的簡便高效基因編輯技術[10,12]，因操作簡單易行，目前已廣泛應用于基因功能研究[13]。該技術首先設計針對靶基因的sgRNA，通過構建重組質粒轉染，使引導序列sgRNA和Cas9蛋白在細胞內表達，sgRNA引導Cas9蛋白至靶基因DNA的目標位置，對雙鏈DNA進行切割。細胞通過NHEJ修復時，靶基因DNA目標區域可出現插入、缺失等突變。

本研究針對犬NPHP1基因第5外顯子設計了3對sgRNA，該位點是NPHP1基因的主要功能結構域SH3結構域，是NPHP1編碼蛋白nephrocystin-1與其他蛋白相互結合的重要位點[14]。nephrocystin-1通過SH3功能結構域與黏附連接相關的酪氨酸激酶配體p130Cas蛋白結合，共表達于黏附連接處，參與了調節細胞黏附連接和細胞骨架組裝的信號通路[15]。Benzing等[16]的研究還表明，nephrocystin-1通過SH3功能結構域與p130Cas蛋白、張力蛋白tensin、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)等在細胞基底側黏附連接處形成蛋白復合體，在腎小管上皮細胞的細胞連接方面發揮重要作用，nephrocystin-1可以調節Pyk2的402位酪氨酸磷酸化，并隨后激活有絲分裂原活化蛋白激酶，參與了Pyk2相關信號通路。nephrocystin-1還可通過SH3功能結構域與PALS1結合調控Par3/Par6/aPKC復合體的Par6磷酸化狀態，促進緊密連接形成[17]。

本研究通過CRISPR/Cas9技術成功構建了NPHP1基因穩定敲除的MDCK細胞。對靶基因目標位置的Sanger測序結果顯示，同源DNA雙鏈均發生了非3N移碼突變，基因型為小片段缺失突變和點缺失突變的復合雜合突變：c.500_551del (p.His167GlnfsTer14) 和c.499delC (p.His167ThrfsTer31)。這兩個突變均使NPHP1的氨基酸序列發生了移碼突變，并使終止密碼子提前出現，破壞了NPHP1基因的SH3功能結構域，使nephrocystin-1蛋白不再表達。同時，通過對本研究引導序列可能發生脫靶的8個位點進行Sanger測序檢測，結果顯示預測脫靶位點均未發現突變，基本排除了本研究構建的NPHP1敲除MDCK細胞的脫靶可能。RT-qPCR和Western blotting檢測顯示，NPHP1表達的mRNA水平顯著受到抑制，編碼蛋白nephrocystin-1蛋白表達完全缺失。NPHP1基因敲除MDCK細胞的細胞形態發生了改變，與通過慢病毒轉染shRNA敲低NPHP1表達的MDCK細胞結果一致，略呈長梭形，細胞間隙稍增大。由此可見，本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建了NPHP1基因穩定敲除的MDCK細胞，這將進一步促進NPHP發病機制的體外研究。