不同干燥方法對金銀花葉主要成分的影響

姜 珊，馬青琳，張康華，張 芳，代 龍，高 鵬

（山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250300）

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）主要含有木犀草苷、忍冬苷等黃酮類成分，綠原酸、異綠原酸等酚酸類成分和以馬錢苷為代表的環烯醚萜苷類成分（劉嬋娟等，2010）。研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗氧化、解熱消炎、抗病毒、降血糖（劉敬盛等，2016；潘秋文等，2004）等藥理作用。近年來金銀花作為藥源需求量日益增加（董熙嘏等，1984）。它的副產品金銀花葉為忍冬的干燥葉，本品產量很高，但其被認為是非藥用部分，并且長期未被利用（武雪芬等，2001）。不同歷史時期忍冬藥用部位各異，在梁代時期藥用部位為莖和葉（朱姮等，2016） 。武雪芬（1997）研究表明，金銀花越冬老葉中黃酮含量分別為金銀花的2.78 倍、 藤的6.98 倍。山東和河南等地區金銀花葉片的綠原酸含量和金銀花相當。華金6 號金銀花是山東中醫藥大學經過10 余年培育出的金銀花新品種。該品種金銀花葉資源豐富，成本較低，可作為飼料添加劑，具有很高的開發價值。

研究表明，干燥方法會影響藥材的品質。金銀花葉不同干燥方式對綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、總酚酸、 總黃酮和總環烯醚萜苷成分含量的影響鮮見報道。本試驗考察陰干法，真空干燥法、烘干40、50、60、70、80、100 ℃條件下，金銀花葉主要成分的含量變化，以期為金銀花葉的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 高效液相色譜儀（島津LC-2030，自動進樣，UVD 檢測器），COSMOSIL 5C18-MS-II色譜柱 （4.6×250 mm，5 μm），Welch Ultimate XBPhenyl （4.6×250 mm，5 μm），紫外-可見光光度儀（上海儀電分析儀器廠，L3S），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司 ，KQ-250），高速粉碎機（上海兆申科技有限公司，XS-02），電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL-204），移液槍（Dragon-Lab），真空干燥箱 （上海精宏試驗設備廠，DZF-6051），電熱鼓風干燥箱（林茂科技，101 型）。

綠原酸標準品 （中檢院，批號 110753-201716），馬 錢苷 對 照品 （中 檢 院 ，111640-201606），木犀草苷對照品（中檢院，批號111720-201609），甲醇（色譜純），乙醇（分析純），乙腈（色譜純），冰乙酸（色譜純），磷酸（色譜純），娃哈哈純凈水。

1.2 金銀花葉采集 2018 年6 月于山東中醫藥大學藥用植物園采集金銀花枝條中部葉片，樣品經山東中醫藥大學鑒定為華金六號金銀花葉。取適量金銀花葉經干燥粉碎后，于索氏提取器中回流至石油醚無色，金銀花葉粉末揮干石油醚后備用。

1.3 干燥方法 將華金六號金銀花鮮葉分為8組，每組約150 g，按表1 條件進行干燥。

表1 金銀花葉干燥方式及條件

1.4 指標成分含量測定

1.4.1 綠原酸含量測定 對照品溶液的制備：取適量綠原酸對照品，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成0.04 mg/mL 的溶液，10 ℃以下保存（中國藥典，2015）。

供試品溶液的制備：取約0.5 g 金銀花葉粉末（過四號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理 （功率250 W，頻率 35 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

色譜條件：使用C18 柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13 : 87）為流動相。檢測波長為 327 nm，流速1 mL/min，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖1。

1.4.2 木犀草苷含量測定 對照品溶液的制備：取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中國藥典，2015）。

圖1 綠原酸對照品（A）和綠原酸供試品（B）HPLC 色譜圖

供試品溶液的制備：取約2 g 金銀花葉粉末（過四號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率 35 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

色譜條件：使用苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以乙腈作為流動相A 和0.5%冰醋酸溶液作為流動相B 進行梯度洗脫；檢測波長為350 nm。流速1 mL/min，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖2。

圖2 木犀草苷對照品（A）和木犀草苷供試品（B）HPLC 色譜圖

1.4.3 馬錢苷含量測定 對照品溶液的制備：取適量馬錢苷對照品，精密稱定，加50%甲醇制成每 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中國藥典，2015）。

供試品溶液的制備： 取約1 g 金銀花葉粉末（過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理 （功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。

色譜條件： 使用苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）為流動相。檢測波長為 236 nm，流速 1 mL/min，柱溫 25 ℃。色譜圖見圖3。

圖3 馬錢苷對照品（A）和馬錢苷供試品（B）HPLC 色譜圖

1.4.4 總黃酮含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷對照品適量，加60%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量60%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）50 min，用 60%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照李志明等（2006）總黃酮含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液 1 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.9 mL、80℃烘干金銀花葉醇提液1 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，于350 nm 測吸光度，計算總黃酮濃度。

1.4.5 總酚酸含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸標準品適量，加70%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照宋琳琳等（2013）總酚酸含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.4 mL、真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液0.3 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.8 mL、80 ℃烘干金銀花葉醇提液1 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于327 nm 測吸光度，計算總酚酸濃度。

1.4.6 總環烯醚萜苷含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取馬錢苷對照品適量，加90%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入15 倍量90%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 90%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用90%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照王赟等（2011）總環烯醚萜苷含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、80 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，用90%乙醇定容至刻度，于236 nm 測吸光度，計算總環烯醚萜苷濃度。

1.5 各指標成分方法學考察

1.5.1 綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量測定方法學考察

1.5.1.1 標準曲線的繪制 分別取綠原酸、 馬錢苷、木犀草苷對照品，按各成分色譜條件注入色譜儀，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標進行回歸分析，見表2。

1.5.1.2 精密度試驗 分別取 “2.3.1”、“2.3.2”、“2.3.3”中制備的供試品溶液，按各指標成分色譜條件，連續進樣6 次，記錄峰面積，綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量的RSD 值見表3，結果表明方法精密度良好。

表2 線性關系考察

1.5.1.3 穩定性試驗 分別取“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”中制備的供試品溶液，按各指標成分色譜條件，分別于 2、4、6、8、12、24 h 進樣，記錄峰面積，綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量的RSD 值見表3。

1.5.1.4 重復性試驗 分別取6 份金銀花葉供試品溶液，按各指標成分色譜條件，進樣后綠原酸、馬錢苷、木犀草苷峰面積的RSD 值見表3，表明重復性良好。

1.5.1.5 加樣回收率試驗 分別取已測定指標成分量的金銀花葉樣品溶液6 份，精密稱定，加入對照 品 0.0412 mg/mL 綠 原 酸 、0.0388 mg/mL 馬 錢苷、0.04164 mg/mL 木犀草苷各0.4 mL，按照各指標成分色譜條件進樣測定。計算得綠原酸、 馬錢苷、 木犀草苷平均回收率分別為 99.61%、100.05%、 99.78%，RSD 值見表3。

1.5.2 總黃酮、總酚酸、總環烯醚苷含量測定方法學考察

1.5.2.1 標準曲線的繪制 分別取綠原酸、 馬錢苷、木犀草苷對照品，在 327、236、350 nm 下測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品濃度為橫坐標進行回歸分析，見表2。

1.5.2.2 精密度試驗 分別取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制備的供試品溶液，在 350、327、236 nm下測定總黃酮、總酚酸、總環烯醚萜苷的吸光度，連續測定 6 次，RSD 值見表3。

1.5.2.3 穩定性試驗 分別取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制備的供試品溶液，在 350、327、236 nm下分別測定總黃酮、總酚酸、總環烯醚萜苷2、4、6、8、12、24 h 后供試品溶液的吸光度，RSD 值見表3。

1.5.2.4 重復性試驗 取金銀花葉供試品溶液6份，分別在 350、327、236 nm 下測定總黃酮、 總酚酸、總環烯醚萜苷吸光度，RSD 值見表3。

1.5.2.5 加樣回收率試驗 分別取已測定指標成分量的金銀花葉樣品溶液6 份，加入0.1816 mg/mL木犀草苷對照品0.4 mL、0.1936 mg/mL 綠原酸對照品 0.2 mL、0.1928 mg/mL 馬錢苷對照品0.5 mL，分別在 350、327、236 nm 下測定總黃酮、總酚酸、總環烯醚萜苷吸光度，計算的平均回收率分別為98.76%、99.06%、101.1%。RSD 值見表3。

表3 指標成分方法學考察RSD 值 %

1.6 數據分析 采用Graphpad Prism 繪制相應的圖表，IBM SPSS Statistics 21 分別對綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、總酚酸、總黃酮、總環烯醚萜苷進行單因素方差分析和多重比較，Microsoft excel 2016 對數據進行處理。

2 試驗結果

2.1 干燥方法對金銀花葉失水率及外觀的影響從表4 可以看出，不同烘干溫度對金銀花葉外觀存在影響，溫度越高，金銀花葉顏色越深。

表4 不同干燥方法金銀花葉失水率及外觀顏色

2.2 綠原酸、馬錢苷和木犀草苷的含量測定結果由圖4 可知，金銀花葉中綠原酸、馬錢苷和木犀草苷的含量因不同干燥方式而存在顯著差異。綠原酸含量在40 ℃烘干時最高，為40.9692 mg/g。在陰干和100 ℃烘干條件下，綠原酸含量無顯著性差異。真空 60 ℃和 50、60、80、70 ℃烘干條件下綠原酸含量存在顯著性差異，其中70 ℃烘干處理時綠原酸含量最低。馬錢苷含量以40 ℃烘干含量最高，為35.3032 mg/g。八種不同干燥方式下馬錢苷含量存在顯著性差異，馬錢苷含量由高到低排序為 40 ℃烘干＞真空 60 ℃烘干＞50 ℃烘干＞100 ℃烘干＞陰干＞60 ℃烘干＞80 ℃烘干＞70 ℃烘干。木犀草苷在陰干條件下含量最高，為15.4562 mg/g。真空60 ℃烘干、80 ℃烘干和100 ℃烘干干燥方式對木犀草苷含量無顯著影響且木犀草苷含量最低。八種不同干燥方式下，綠原酸、馬錢苷含量總體趨勢一致，從陰干、 真空60 ℃烘干到40 ℃烘干，含量逐步上升。50、60、70 ℃烘干時綠原酸和馬錢苷含量呈現遞減趨勢，且在70 ℃烘干時含量達到最低水平，隨著溫度的升高，在80 ℃烘干和100 ℃烘干條件下，兩者含量逐步增加。木犀草苷含量在70 ℃烘干條件下最低，為0.9554 mg/g，在80 ℃烘干和100 ℃烘干時呈現增長趨勢。

圖4 綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量測定

2.3 總酚酸、總黃酮、總環烯醚萜苷含量測定結果 結果見圖5，不同干燥方式對金銀花葉總酚酸、總黃酮和總環烯醚萜苷的含量影響顯著?？偡铀岷恳?0 ℃烘干時最高，其次為陰干，二者無顯著性差異，其含量在60 ℃烘干時最低，為18.5333 mg/g，與70 ℃烘干無顯著性差異?？傸S酮含量以40 ℃烘干最高，為54.0721 mg/g，其次為陰干法，二者無顯著性差異，60 ℃烘干時總黃酮含量最低?？偔h烯醚萜苷含量因烘干方法不同明顯分為四組，四組間差異顯著。其含量以陰干和40 ℃烘干最高，二者無顯著性差異。其次為真空60 ℃烘干，50 ℃烘干和 100 ℃烘干，三者之間無顯著性差異。70 ℃烘干和80 ℃烘干時總環烯醚萜苷含量最低，二者之間無顯著性差異，分別為54.7235 mg/g 和 56.2156 mg/g。

圖5 總酚酸、總黃酮、總環烯醚萜含量測定

3 分析與討論

葉綠素主要有 2 種，葉綠素 a 在 645 nm 和663 nm 處均有吸收，在645 nm 處吸光系數較??；葉綠素b 在645 nm 和663 nm 處亦都有吸收，但在645 nm 處吸光系數較大，在663 nm 處較小。本試驗總黃酮、 總酚酸和總環烯醚萜苷含量測定所用吸光度分別為350、327 nm 和236 nm，處于葉綠素吸收曲線波谷位置，且樣品經25 倍稀釋，影響甚微。本試驗前期預試驗取金銀花葉經干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號藥典篩），于索氏提取器中回流至石油醚無色，后置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。后取1 mL 提取液于25 mL 棕色容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。取未脫色金銀花葉粉末按上述條件進行制備提取液后稀釋相同倍數。測石油醚脫色后和未脫色總酚酸吸光度分別為0.361 和0.362相差不大，可以接受，故用醇提液直接測總成分含量。參考宋琳琳等（2013）和羅海青等（2018）報道方法，紫外分光光度法測定蒼耳草總酚酸和黃皮葉總黃酮含量中，經50%甲醇提取液和70%乙醇提取液后用比色法在波長326 nm 和503 nm 處測定總酚酸和總黃酮含量，也不涉及脫去醇溶性葉綠素的步驟?？梢姶既苄匀~綠素對試驗結果的影響可忽略不計。

總酚酸、 總黃酮和總環烯醚萜苷的含量用紫外分光光度計法分別以綠原酸、 木犀草苷和馬錢苷為對照品于 327、350 nm 和 236 nm 處測定。李志明等（2006）測得金銀花和葉總黃酮樣品提取液最大吸收位置為363 nm 左右。本課題組對金銀花葉總黃酮提取液進行全波長掃描測定，金銀花葉總黃酮提取液最大吸收波長在355 nm左右，因木犀草苷在350 nm 處有最大吸收，故本試驗以木犀草苷為對照品于350 nm 測定總黃酮樣品提取液的吸光度，進而測得總黃酮含量。宋琳琳等（2013）和王赟等（2011）研究表明，總酚酸提取液在326 nm 處、總環烯醚萜苷提取液在238 nm 處有最大吸收。綠原酸和馬錢苷最大吸收波長分別為327 nm 和236 nm，故本試驗分別以綠原酸和馬錢苷為對照品于327 nm 和236 nm 處測定總酚酸和總環烯醚萜苷樣品提取液的吸光度，進而測定含量。

通常認為，金銀花葉顏色越深，其有效成分含量越低。但是本試驗測得在80 ℃烘干和100℃烘干時，金銀花葉中大多數有效成分含量反而呈現遞增趨勢，與張永清等（1999）得出的干燥后藥材外觀色澤深淺與其綠原酸含量呈負相關，即藥材色澤越深，綠原酸含量越低的結論有差異。此外，不同厚度下干燥金銀花葉對其外觀性狀及有效成分含量也有影響。較薄時金銀花葉干燥過度，導致色澤發黑、蜷縮嚴重，金銀花外觀形狀較差同時單層物料內的氧化酶對溫度變化敏感，易被激活，從而使多種有效成分含量降低而影響金銀花葉質量。金銀花葉太厚時，干燥不均勻，水分含量較高且干燥程度不均勻，干燥時間過長導致金銀花葉顏色變深，影響金銀花葉品質（趙桂明，2013）。

綠原酸含量的高低是金銀花質量好壞的標準，也是干燥后成品檢驗的一個重要指標（吉永奇等，2008）。綠原酸屬于植物體內的次生代謝產物，其極易在多酚氧化酶的作用下氧化縮合成高分子的有色物質發生褐變 （張永清等，1998）。當溫度低于氧化酶的變性溫度時，溫度越高，多酚氧化酶的活性越高，綠原酸由于酶的作用含量逐步減少。當溫度過高使酶失去活性，綠原酸氧化縮合作用減少，含量呈現上升趨勢（彭菊艷等，2006）。金銀花葉含有較多的氧化酶，高溫能滅活金銀花葉中各種酶，使綠原酸、木犀草苷的損失達到最小化（陳燕文等，2017）。然而，綠原酸是一種極性有機酸酯，其性質不穩定且易于分解（謝娟平等，2015） 。長時間強光及高溫干燥使綠原酸結構遭到破壞，從而使其含量降低（何希瑞等，2013）。與綠原酸類似，木犀草苷結構中也含有多個酚羥基，對熱的穩定性也較差。從干燥工藝來看，真空干燥應該優于其他干燥方式，但試驗結果恰恰相反，這可能是由于真空干燥后得到的產品膨松多孔而使金銀花葉極易被氧化所致（陳德經，2006）。金銀花葉中的氧化酶對有機酸類成分的氧化起到了催化作用，所以總有機酸的損失相對較多。高溫還可促使金銀花葉中分解黃酮的氧化酶失活，又進一步減少了黃酮類成分的破壞（石曉晨等，2018）。但是過高的溫度會破壞總酚酸和總黃酮結構，使其含量降低?？傸S酮、總酚酸和總環烯醚萜苷含量于70 ℃烘干時含量達到最低，80 ℃和100℃烘干后含量上升，可能是由于在加熱過程中某些物質發生了成分的分解轉化，影響了總黃酮、總酚酸和總環烯醚萜苷的含量。

4 結論

本試驗結果表明，除木犀草苷外，在40 ℃烘干時5 種成分含量均呈現出最大值，此外總黃酮、總酚酸、總環烯醚萜苷三種成分同時在陰干和40 ℃烘干時呈現出較高含量。隨著烘干溫度的升高，大多數有效成分的含量在70 ℃烘干時最低，80 ℃和100 ℃烘干時含量呈現上升趨勢，這個上升過程是否是由于加熱使金銀花葉內的成分發生分解轉化，或是由于高溫使金銀花葉結構發生改變，釋放出所測成分還有待于進一步試驗研究。