低溫嗜堿性纖維素降解細菌的分離與鑒定

孟建宇，丁雪敏

（內蒙古農業大學生命科學學院應用與環境微生物研究室，內蒙古呼和浩特010011）

經濟和人口的快速增長使得環境污染及能源危機等問題日益顯著，因而尋找這些問題的解決方法尤為重要。纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一 （林燕萍，2018；Patyshakuliyeva 等，2016），利用纖維素酶將自然界中的纖維素物質降解后可重新利用，其對于緩解能源危機及環境污染問題等有重大意義。中高溫纖維素降解菌的降解活性在寒冷環境中有很大程度上的降低，而低溫纖維素降解菌所產生的纖維素酶具有獨特的適應機制，使反應在低溫環境中仍然進行，無需加熱和冷卻等額外條件 （李春艷等，2015；王玢等,2003）。因此利用低溫纖維素降解菌可達到生產成本低廉、節約能源的目的，從而使纖維素的降解在低溫環境中呈現出極大的優勢 （張麗珉等，2018；董碩等，2011；王世杰等，2011），故尋找高效的低溫纖維素降解菌是目前研究的熱點。

在降解纖維素的微生物中，真菌降解纖維素的能力較為突出，但因生長比較緩慢、不耐熱、不耐堿性等限制了其工業化的發展 （ Ruijssenaars等，2004）。但細菌擁有來源廣、種類多、生長快、適應極端環境能力強等特點，使工業化生產易實現，故顯現出了巨大的應用前景，堿性纖維素酶耐堿性強、熱穩定性好、發酵周期短（Li 等，2012），在廢水處理、紡織、造紙和洗滌等行業有較高的應用價值。而國內外對堿性低溫纖維素降解細菌的研究報道相對較少（李強等，2012）。

內蒙古西部地區土壤鹽堿化較普遍，秋冬季節持續時間長且年平均氣溫偏低，是低溫嗜堿性微生物生長的適宜環境。本研究在4 ℃條件下，對內蒙古西部地區土壤中具有降解纖維素能力的細菌進行篩選，以挖掘高效的低溫纖維素嗜堿性纖維素降解菌，為解決環境污染及能源危機等問題提供一種可持續發展的生物措施。

1 材料與方法

1.1 樣品 樣品采自內蒙古西部地區鹽堿地的表層土壤，4 ℃冰箱保存備用。

1.2 培養基配方 富集培養基： 秸稈末 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 9.0。

分離培養基：CMC-Na 5 g，酵母提取物 2 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 9.0。

1.3 菌株的分離純化 將采回的土樣充分混合后加入以秸稈為唯一碳源的pH 為9 的富集培養液中，4 ℃下富集培養10 d，轉接新鮮培養基再次富集，轉接3 次。取10 mL 富集液加入含90 mL無菌水的三角瓶中，置于 120 r/min 搖床中振蕩1 h，充分混勻，然后將富集后的樣品溶液稀釋成10-2～10-5稀釋度的溶液，涂布于分離培養基，4 ℃培養10 d。挑取不同形態、顏色的單菌落進行純化，獲得純培養物。

1.4 菌株的鑒定 對分離的菌株進行細菌DNA的提?。ê鷷约t等，2008）后，用細菌通用引物對27F 和1492R 進行PCR 擴增，擴增產物回收純化后送上海生工測序公司測序。將測序的結果利用RDP 在線程序Classifier 及NCBI 數據庫的Blast-n程序進行相似性比對分析。

1.5 酶活性測定 用DNS 法測定酶活性。在1 mL粗酶液中加入 2 mL 1%（W/V） 的 CMC-Na 緩沖液，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入2.5 mL DNS 試劑，于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后定容25 mL，用酶標儀測定540 nm 下的吸光值。

酶活力定義： 在50 ℃的反應條件下，1 min 內催化底物生成1 μmoL 葡萄糖所需的酶量為1 IU/mL。

2 結果與分析

2.1 低溫堿性纖維素降解細菌的分離篩選 以CMC-Na 為唯一碳源，從內蒙古西部地區偏堿性土壤樣品中篩選嗜堿低溫纖維素降解細菌，共獲得5株具纖維素降解能力的菌株：X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和X3-1，其菌落形態特征如表1 所示。

表1 菌落形態特征

2.2 16 S rDNA 序列同源性分析 本研究采用細菌16S rDNA 通用引物對所提取的純菌菌株X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和 X3-1 的 DNA 進行了16S rDNA PCR 擴增，擴增產物電泳結果見圖1。由圖可見，PCR 產物片段清晰且單一，均約為1.5 kb，與預期目的片段長度接近。

圖1 16S rDNA PCR 電泳檢測圖

對測序所得序列，根據測序圖譜峰型截取合適長度后，利用NCBI 數據庫的Blast-n 程序對其進行16S rDNA 序列分析以確定菌株的種屬關系。通過結合細菌形態特征和利用NCBI 數據庫的Blast-n 程序對測序獲得的部分長度16S rDNA序列（821 bp）進行了同源性分析（表2），結果表明菌株 X2（3）與 Paenibacillus 最同源，同源性達到99%，推測其為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的一個種。菌株 X6-1 與 Sphingobacterium daejeonense 最同源，同源性達到100%，推測其為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）的一個種。菌株X4（1）與Microbacterium 最同源，同源性達到 99%，推測其為微桿菌屬（Microbacterium）的一個種。菌株 X3-1 與 Pseudomonas 最同源，同源性達到98%，推測其為假單胞菌屬（Pseudomonas）的一個種。菌株 X7-1 經分析為 Uncultured bacterium clone，在Blast-n 分析中未找到同源菌。

表2 菌種鑒定和Blast-n 同源性分析結果

2.3 酶活測定 對分離得到的菌株進行酶活測定，相對酶活性為 24～29 IU/mL，菌株 X2（3）酶活最高，為28.60 IU/mL，菌株X7-1 酶活最低，為23.72 IU/mL（表3）。

表3 菌株酶活測定

3 討論

目前纖維素酶產生菌的研究主要集中在真菌，且研究較多的是木霉屬、曲霉屬、真菌屬等產生的酸性纖維素酶（劉森林等，2008），而對細菌降解纖維素的研究較少（崔秀秀等，2016；Brown 等，2014），尤其是可產生堿性纖維素酶的低溫細菌。本文對內蒙古西部地區堿性土壤中的低溫嗜堿性纖維素降解菌進行分離，最終得到五株具有較高酶活性的低溫嗜堿性纖維素降解菌。通過16S rDNA 序列同源性分析顯示菌株X2（3）屬于類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），酶活性為 28.60 IU/mL；菌株 X6-1屬于鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），酶活性為24.65 U/mL；菌株 X4（1）屬于微桿菌屬（Microbacterium），酶活性為 26.02 IU/mL 菌；菌株 X3-1 屬于假單胞菌屬 （Pseudomonas），酶活性為 24.41 IU/mL；菌株X7-1 在Blast-n 中未找到其同源菌，推測可能為該菌株可能屬于新的菌屬，酶活性為23.72 IU/mL。得到的五株低溫嗜堿性纖維素降解菌的酶活性均高于已報道文獻的酶活性（何海燕等，2019；陳雅娟等，2014；迪麗拜爾·托乎提等，2013；劉森林等，2005）。今后可利用液體發酵進一步研究五株低溫嗜堿性纖維素降解菌發酵的最適條件、發酵的最適底物、酶作用的最適條件等，為開發應用高效的低溫纖維素嗜堿性纖維素降解菌奠定基礎。