地質封存CO2泄漏對蚯蚓的毒性效應

趙晨陽，馬俊杰,2,*，薛璐,3，田園，劉丹

1. 西北大學，西安 710127 2. 二氧化碳捕集與封存技術國家地方聯合工程研究中心，西安 710127 3. 榆林學院，榆林 719000

二氧化碳捕集與封存技術(CO2capture and storage, CCS)是清潔能源技術的關鍵部分，為減少溫室氣體排放、確保能源安全提供了一條可持續的道路[1]。CCS項目是將從排放源捕集的CO2注入到盆地的石油與天然氣儲層、深層咸水層和不可開采的煤層[2]等穩定的地質構造中，達到捕碳減排的效果[3]。CCS工程的“高效性”取決于“零泄漏”的保障[4]，但由于封存的地質條件和人類活動的不確定性，注入的CO2存在著通過泄漏井、斷層或裂縫以及蓋層的“薄弱帶”(局部高滲帶)產生泄漏的風險[5-7]，加之我國地形條件復雜，生態環境脆弱，一旦發生泄漏，其風險會遠高于其他國家[8]。CCS泄漏將會對近地表陸地生態系統產生直接威脅，這已經成為CCS技術最大的環境風險[9]。

最近網絡科學安全研究所(RISCS)的研究表明，地質封存CO2泄漏引起的土壤中CO2濃度的增加比任何相關的、短暫的和大氣水平的輕微上升具有更顯著的影響[10]。已有研究證實，CCS泄漏[11-12]可導致土壤CO2濃度升高、土壤酸化[13]以及土壤O2含量減少[14]，在CO2泄漏中心區域，泄漏量可達2 000～3 000 g·m-2·d-1，土壤CO2濃度接近100%[13]，會對土壤生態系統以及植物帶來極大的危害。同時，CO2泄漏會對土壤微生物群落及土壤酶活性產生顯著影響。張旺園等[15]研究得出，隨著土壤CO2濃度增加，土壤微生物多樣性逐漸降低，結構趨于單一，土壤酶活性變化明顯。張慧慧等[16]通過變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析得出，高濃度CO2長期入侵土壤包氣帶，能促進細菌、真菌生長，抑制放線菌的生長；真菌對CO2脅迫表現更為敏感?；贑O2泄漏對土壤性質以及土壤微生物的研究，地質封存CO2泄漏對土壤大型動物的影響知之甚少。

蚯蚓作為土壤大型動物的代表，是土壤生態系統非常重要的組成部分，其生命活動過程可改善土壤結構、提高土壤肥力，它對土壤生態系統的貢獻已被廣泛認識[17-18]；蚯蚓作為的“生態系統工程師”，是許多動物的食物來源，也是土壤生物、土壤生態環境與陸地生物之間(營養)信息傳遞的橋梁[19-21]，在地球物質循環和陸地生態系統食物鏈的物質傳遞中擔負著重要功能[22]。同時，蚯蚓對土壤中外源性污染物非常敏感，是最易受到環境有毒有害物質傷害的土壤生物之一，因而也是土壤污染生態風險評價的重要指示生物。

本研究以蚯蚓作為研究對象，通過模擬地質封存CO2泄漏后可能產生的土壤高濃度CO2環境，研究土壤高濃度CO2對蚯蚓的形態變化、皮膚及表皮損傷、死亡率、體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(NRRT)等生長與生理毒性效應，明確土壤高濃度CO2對土壤典型動物蚯蚓的影響，以期為CCS項目的風險評估以及泄漏的識別提供參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 蚯蚓

按照蚯蚓的生態習性，可將蚯蚓分為表棲型、內棲型和深棲型3類[23]。從CCS項目CO2泄露特征而言，一般具有下部濃度高表層濃度低的特點。關笑坤[24]采用250 cm土柱進行CO2泄露擴散模擬實驗，發現30 cm深度處CO2濃度可達250 cm深度處的80%。通過預實驗得出，5 cm和10 cm深度處CO2濃度可分別達到30 cm深度處的15%和45%。以250 cm深度處CO2濃度100%為參照，則5 cm和10 cm深度處CO2濃度可達到12%和36%。近表層土壤對深部CO2泄露有比較明顯的響應，其濃度值也明顯超過該層位土壤正?；顒訒rCO2最高濃度(4%)。為了便于通過土壤動物蚯蚓開展CCS項目中CO2泄露風險監測，本文以易于發現、易于采樣的表居型蚯蚓——赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)為實驗對象，其取自陜西卻行生物科技有限公司(陜西楊凌)養殖場，在實驗室用牛糞作為飼養基質，于室溫下長期培養。實驗時選取體重為400～500 mg、生殖環帶明顯且大小一致的成年蚯蚓。

1.1.2 供試土壤

實驗土壤采自西安市長安區某農田表層土(0～20 cm)，土壤的基本理化性質如表1所示，該土壤為弱堿性高有機質沙質粘土。

1.1.3 主要儀器和試劑

實踐證明，耐密型玉米品種相比稀植大穗品種具有較大的增產潛力。通過對建昌縣耐密玉米種植現狀和推廣對策分析，引導全縣農民改變種植觀念，廣泛種植耐密玉米品種，通過增加密度和集成耐密型玉米高產栽培技術，實現玉米種植的高產高效。

試劑：二甲基亞砜、中性紅指示劑(C15H17N4Cl)、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、戊二醛、無水乙醇和乙酸異戊酯等，以上試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

主要儀器：光學顯微鏡(型號OLYMPUS CX23，山東博科科學儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(型號SU3500，深圳市三昊儀器設備有限公司)；動物培養箱(型號YCP-160D，長沙華曉電子科技有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

本實驗用動物培養箱來模擬CCS技術中CO2發生泄漏后可能產生的高濃度CO2環境。該培養箱可以通過傳感器及其反饋系統控制箱體內CO2的濃度，以達到控制土壤CO2濃度的目的，該培養箱也可以控制溫度和光照度，其CO2濃度量程可以到達100%。各參數均可以多級調節，可以根據實驗的需要設定相應的目標值。具體裝置如圖1所示。

本實驗參考經合組織化學品測試準則(OCED 207)[25]的方法開展蚯蚓毒性實驗。首先通過預實驗得出蚯蚓全存活的最高濃度為8%，全致死的最低濃度為48%。在此基礎上，確定適用于開展蚯蚓毒性實驗的CO2濃度分別為：CK(對照組)、10%、20%、30%、40%和48%共6個濃度梯度。實驗時將馴化一周的蚯蚓放入鋪有濕潤濾紙的培養皿中清腸24 h，用0.9%的生理鹽水沖洗蚯蚓表面并用濾紙擦干。稱取500 g實驗土樣于實驗盒中，加入適當蒸餾水，調節土壤含水率，使得土壤含水率為最大持水量的60%。然后將10條清腸后的蚯蚓放入土壤表面，任其自由活動，實驗盒用紗布封口，橡皮筋捆扎，防止蚯蚓逃逸。將實驗盒放入培養箱中培養，保持箱內恒溫(20±1) ℃，提供連續的光照，適時補充水分，每個處理設置3個重復。

圖1 動物培養箱Fig. 1 Animal incubator

表1 實驗土壤基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of experimental soil

1.2.2 指標測定

形態變化與皮膚損傷：在實驗過程中觀察蚯蚓形態變化，并通過掃描電鏡觀察暴露7 d后各濃度梯度下存活的蚯蚓皮膚，拍照記錄皮膚損傷情況。具體操作步驟按照謝顯傳[26]所描述的方法進行試驗，對蚯蚓進行清腸、取材、固定、清洗、脫水、置換和干燥等處理后用掃描電鏡觀察。

蚯蚓死亡數與死亡率統計：分別在7 d和14 d記錄每個濃度梯度下蚯蚓的死亡數，實驗中將蚯蚓頭、尾部受到機械刺激而無反應認為是已經死亡[19]，根據死亡率=(死亡數/總數量)×100%計算得出蚯蚓的死亡率。

蚯蚓體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(neutral red retention time, NRRT)測定方法如下。由于污染物會使蚯蚓溶酶體膜受損，導致中性紅染料釋放，體腔細胞變紅。因此，用NRRT變化來指示蚯蚓受到的污染脅迫，NRRT越長，毒害作用越弱；NRRT越短，毒害作用越強。實驗分別取暴露7 d和14 d后不同CO2濃度下存活的蚯蚓測定NRRT，根據Maboeta等[27]所描述的方法進行測定。用中性紅工作液(20 mg中性紅溶于1 mL二甲基亞砜)染色，在光學電子顯微鏡下觀察并實時記錄整個染色過程，當視野中超過50%的體腔細胞被染成粉紅色，觀察結束，記錄NRRT。

1.3 數據分析

采用SPASS11.5和origin8.0進行數據分析與作圖，數據表示為平均值±標準差(AV±SD)，高濃度CO2對蚯蚓的半數致死濃度(LC50)通過線性回歸法求出。

2 結果(Results)

2.1 蚯蚓形態變化與皮膚損傷

土壤高濃度CO2使蚯蚓的形態發生了變化。在暴露1初期，蚯蚓出現了卷曲現象；隨著暴露時間的延長，蚯蚓表現出生殖環帶腫大、尾部串珠以及斷尾等中毒現象；在實驗過程中還觀察到，受損蚯蚓皮膚表面不像正常蚯蚓一樣保持濕潤，有蚯蚓死亡在土壤表層甚至發生自溶。

通過掃描電鏡觀察蚯蚓在不同CO2濃度下暴露7 d后的皮膚狀況。CK組蚯蚓的皮膚表面光滑緊湊、組織良好(圖2(a))；CO2濃度為10%時，蚯蚓皮膚出現局部損傷(圖2(b))；CO2濃度為20%時，蚯蚓皮膚損傷面積擴大、程度加深，個別環節收縮變細(圖2(c))；CO2濃度為30%時，蚯蚓表皮紋理變粗并出現與皮膚損傷連帶性的明顯組織損傷(圖2(d))；CO2濃度為40%時，發生大面積皮膚損傷，整個皮膚表面非常粗糙，褶皺明顯(圖2(e)、2(f))。

通過觀察蚯蚓剛毛發現，CK組蚯蚓的剛毛完整、排列整齊(圖3(a))；隨著土壤CO2濃度升高，蚯蚓的剛毛銳度降低，出現不同程度的開裂及斷裂現象(圖3(b)～3(d))。

進一步放大觀察蚯蚓的表皮紋理變化(圖4)，在同樣的放大倍數(1 000倍)下，CK組蚯蚓表皮裂隙規整順直，裂隙間緊致有序(圖4(a))；隨著CO2濃度的增加，蚯蚓的表皮裂隙逐漸加寬、彎曲度增大，表皮裂隙間紋理逐漸模糊，部分裂隙間出現細胞碎屑及其分泌物(圖4(b)～4(e))。

2.2 蚯蚓死亡數與死亡率

在實驗的第7天和第14天分別統計不同CO2濃度下蚯蚓的死亡數與死亡率(圖5、圖6)。由圖5可知，在暴露7 d和14 d時，CK組的蚯蚓均未出現死亡。在不同CO2濃度下暴露7 d后，隨著CO2濃度的增加蚯蚓死亡數隨之增加，10%濃度組開始出現蚯蚓死亡，48%濃度組蚯蚓死亡率達到100%。當暴露時間為14 d時，蚯蚓死亡數呈現出與暴露7 d時相似的規律，但死亡率明顯增加，在CO2濃度為40%時蚯蚓的死亡率已達100%。通過線性回歸方法分析蚯蚓死亡率與CO2濃度的關系(圖6)可知，受到高濃度CO2污染的土壤對蚯蚓產生了致死效應，土壤高濃度CO2對蚯蚓的7 d半致死濃度(7 d-LC50)和14 d半致死濃度(14 d-LC50)分別為26.39%和17.78%，LC50隨染毒時間的延長而降低。

2.3 體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(NRRT)

在不同CO2濃度下，選擇第6分鐘拍照記錄蚯蚓體腔細胞溶酶體染色情況(圖7)。由圖7可知，隨著CO2濃度的增加，視野內體腔細胞的染色數量(紅色)逐漸增加。

圖2 暴露7 d時不同CO2濃度下蚯蚓的皮膚損傷情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e)～(f). 40%。Fig. 2 Skin damage of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e)～(f). 40%.

圖3 暴露7 d時不同CO2濃度下蚯蚓剛毛受損情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 30%; (d). 40%。Fig. 3 Setae damage of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 30%; (d). 40%.

圖4 暴露7 d后不同CO2濃度下蚯蚓表皮的變化注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%。Fig. 4 Epidermis changes of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%.

圖5 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓的死亡數Fig. 5 Earthworm deaths at different CO2 concentration and exposure time

圖6 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓死亡率的變化Fig. 6 Changes of earthworm mortality under different CO2 concentration and exposure time

圖7 暴露7 d時健康蚯蚓及暴露于不同CO2濃度土壤中的蚯蚓體細胞染色6 min時的情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%。Fig. 7 Staining conditions of earthworm cells at 6 min in healthy earthworms and earthworm exposed to soil with different CO2 concentrations after 7 dNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%.

7 d組和14 d組在不同CO2濃度下存活蚯蚓的體腔細胞溶酶體NRRT結果如圖8所示，由圖8可知，當暴露時間相同時，隨著CO2濃度的升高，體腔細胞溶酶體NRRT不斷減??；當CO2濃度相同時，隨著暴露時間的增加，體腔細胞溶酶體NRRT也會縮短。即隨著CO2濃度的升高以及作用時間的增加，體腔細胞溶酶體NRRT不斷減小，說明CO2對蚯蚓溶酶體膜的毒性作用在增強。

體腔細胞溶酶體NRRT抑制率(IRNRRT)，表示在一定條件下，各種污染物對蚯蚓體腔細胞溶酶體正常功能的抑制作用，與污染物濃度呈正相關。NRRT抑制率與NRRT的關系可表達為：

IRNRRT(%)=(NRRTCK-NRRTCI)/NRRTCK

式中：IR為體腔細胞溶酶體NRRT抑制率(inhibition rate)；NRRTCK為對照組體腔細胞溶酶體NRRT；NRRTCI為各實驗組體腔細胞溶酶體NRRT。

圖8 不同CO2濃度下暴露7 d和14 d時蚯蚓體細胞溶酶體的中性紅保留時間(NRRT)Fig. 8 The neutral red retention time (NRRT) of earthworm somatic lysosomes exposed to different CO2 concentrations for 7 d and 14 d

在不同CO2濃度下分別暴露7 d和14 d后各處理組體腔細胞溶酶體NRRT抑制率如表2所示。在毒性實驗中得到蚯蚓7 d-LC50和14 d-LC50的土壤CO2濃度分別為26.39%和17.78%，對比之下，當CO2濃度為10%時，蚯蚓7 d和14 d NRRT抑制率分別達到22.2%和41.2%，說明在蚯蚓個體發生死亡之前，蚯蚓體腔細胞溶酶體膜已受到損傷。

3 討論(Discussion)

蚯蚓的體壁由角質層、表皮以及皮下的環肌層、縱肌層等組成。剛毛位于體壁內的剛毛囊中，圍繞蚯蚓的體節排列，是輔助蚯蚓在土壤中移動的幾丁質細胞器(chitinous organelles)[28-29]。剛毛結構的完整性對蚯蚓在土壤中的運動及其生態功能的發揮具有重要的作用。本研究表明，高濃度CO2破壞了蚯蚓的剛毛結構，其可能的原因是高濃度CO2抑制了幾丁質的合成，迫使其結構發生部分或完全變形，同時剛毛受損會引起蚯蚓運動遲緩和掘穴能力減弱，這也解釋了大多數蚯蚓死亡于土壤表面的現象。土壤作為蚯蚓生存的介質，與蚯蚓的表皮直接接觸，高濃度CO2所導致的土壤pH降低、O2濃度減少和濕度降低等改變[30]，可能會對蚯蚓的皮膚及表皮產生直接影響，造成蚯蚓皮膚不同程度的損傷、表皮裂隙和褶皺的明顯變化。實驗中還觀察到蚯蚓發生了身體卷曲、生殖環帶腫大、尾部串珠及斷尾等異常運動及形態變化，此現象與劉馥雯等[31]在研究鉻污染土壤穩定化處理對蚯蚓的毒性效應時和Nusair等[32]在研究二惡英(PCDD/Fs)對Eiseniaandrei蚯蚓的體表影響時所觀察到的現象基本一致。這說明，高濃度CO2污染土壤后，蚯蚓會產生肉眼可見的中毒癥狀。這些現象可能是由于高濃度CO2對蚯蚓體壁微結構損傷的一種宏觀表現。

在實驗暴露7 d和14 d時，隨著土壤CO2濃度的增加，蚯蚓死亡數與死亡率逐漸增加。蚯蚓從背孔分泌粘液保持皮膚濕潤，通過皮膚進行呼吸。本研究表明，隨著暴露濃度的增加和時間的延長，蚯蚓的體表變得干燥，其可能原因是高濃度CO2抑制了粘液的分泌；其次，蚯蚓的呼吸方式為有氧呼吸，當空氣經皮膚吸入時，氧氣被置換至循環系統的環狀心臟，從而通過血液循環輸送氧氣并通過皮膚排除CO2[33]。高濃度CO2使蚯蚓皮膚受損，直接阻礙了蚯蚓呼吸時氣體的交換，這在一定程度上抑制了蚯蚓的呼吸，不能為機體提供足夠的能量，這時蚯蚓不得不依靠組織消耗提供能量，當組織消耗過度時導致蚯蚓死亡。此外，相比于內層種威廉腔環蚓，表層種赤子愛勝蚓也會食取少量的土壤微生物[34]，因此土壤微生物的改變也會對蚯蚓產生影響。Pierce和Sj?gersten[35]通過Asgard平臺試驗，證實了土壤的缺氧和酸化，對大型土壤動物(蚯蚓等)的生存不利，蚯蚓的活性受到抑制。Zhao等[36]對青海省平安縣三合鎮的天然CO2泄漏試驗場的土壤動物的調查結果也表明，在CO2脅迫下，不同種類土壤動物的適應性和耐受性差異較大，其中，蚯蚓對土壤CO2濃度的變化表現最為敏感，隨著CO2濃度的升高，生存率顯著降低。

表2 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓體腔細胞溶酶體膜NRRT抑制率(IRNRRT)Table 2 NRRT inhibition rate (IRNRRT) of lysosome membrane in earthworm lumen cells under different CO2 concentration and exposure time

溶酶體是一種幾乎存在于所有動物細胞中的亞細胞器[37]，對細胞內受損的細胞器、細胞碎片以及外部入侵的微生物的清除與循環利用發揮著重要作用[38]，溶酶體的損害是其濃縮各種污染物的結果[39]。它可以表明一個有機體的健康狀況，常用溶酶體NRRT來評估由污染物引起的溶酶體膜通透性(lysosomal membrane stability, LMS)的改變[40]。本研究結果表明，隨著CO2濃度的增加和暴露時間的延長，NRRT逐漸變短，即CO2對蚯蚓的毒害作用隨著CO2濃度的增加和時間的延長而增強。這種溶酶體膜通透性的增加甚至破壞，可導致組織蛋白酶和其他相關溶酶體水解酶的釋放并進入胞漿，促進細胞程序死亡，被認為是一種細胞死亡的機制[41-43]。雖然此時在不同土壤CO2濃度下，仍有蚯蚓存活，但其健康狀況已經受到了不同程度威脅。所以，盡管暴露于CO2濃度相對較低的污染土壤不一定導致蚯蚓死亡，但蚯蚓溶酶體膜通透性的變化是顯著的。Moore等[44]和Fuchs等[45]學者的研究得出，溶酶體系統的改變通常被認為是蚯蚓暴露于污染物的第一反應，這種有害的溶酶體反應通常發生在細胞和組織病理學之前。也有研究人員證實，蚯蚓溶酶體膜的響應速度遠遠快于其生長、繭產量和繭活力等其他生理反應指標[46-47]。因此，蚯蚓體腔細胞溶酶體NRRT可用作指示地質封存CO2泄漏對蚯蚓種群產生不利影響的早期預警指標，為建立地質封存CO2泄漏近地表監測與識別提供技術參考。但由于溶酶體膜NRRT對CO2并非具有專一性，因此在蚯蚓取樣時，應盡量避免其他導致同類現象的污染存在。

綜上所述，盡管CO2泄露對土壤中蚯蚓的形態、生理及生存影響具有系統性特征，但其研究卻具有明顯的零散性特點，進一步進行高濃度CO2對蚯蚓的血象、酶活性、解剖及超微結構等影響的研究，則更有利于深化其影響的系統性機理認識和挖掘，也有助于利用蚯蚓尋找地質封存CO2泄漏近地表監測與識別的方法。