鎘對大型溞腸道結構及消化酶活力的影響

高菲，林威，王蘭，王茜

山西大學生命科學學院，太原 030006

鎘(cadmium, Cd)是一種生物體非必需的重金屬元素，也是地表水中常見的有毒污染物之一，具有降解難、易轉化和易富集的特點，對水生生態系統造成了嚴重的破壞。水環境中的重金屬污染，尤其是淡水中的重金屬污染已經成為包括我國在內的許多國家需要面對的嚴峻的環境問題[1]。根據淡水環境重金屬污染狀況的研究數據，我國七大水系表層沉積物中重金屬污染程度為：Cd > Hg > Pb > As > Zn > Cr > Cu[2]。且我國多個湖泊的鎘污染程度屬于中度到重度，潛在生態風險系數最高，尤其是東部和中部湖泊的污染更加嚴重[3]，近年來，長江流域沉積物中鎘含量達1.7 mg·kg-1[4]。水體中的鎘經食物鏈積累和放大作用，最終對人體產生影響，引發多種疾病甚至死亡。近年來，我國水體鎘污染事件頻發，對生態環境和人體健康造成了嚴重威脅，因此，引起了許多學者的重視[5]。

水體中的鎘會隨著食物進入水生動物腸道，腸道作為動物消化吸收營養物質的主要器官，也是機體生物轉化和其他生理過程的關鍵結構，維持腸道結構的完整性對鎘的吸收能起到至關重要的屏障作用[6]。研究表明，鎘對果蠅(Drosophila)中腸上皮細胞具有損傷作用，對細胞核膜、線粒體和微絨毛等超微結構造成損傷，并顯著促進中腸干細胞的增殖[7]。鎘污染造成了黃鱸魚(Pelteobagrusfulvidraco)腸道上皮細胞間隙擴張并出現空泡區域，對淀粉酶和脂肪酶活力有抑制作用，造成消化能力變弱，延緩生長[8]。鎘對河南華溪蟹(Sinopotamonhenanense)的腸道上皮的微絨毛造成了顯著的破壞，抑制華溪蟹腸道中淀粉酶和胃蛋白酶的活力[9]。因此，鎘對腸道結構的破壞將影響動物對食物的消化、吸收[6]，消化酶活力的高低可直接反映動物體消化能力的強弱，酶活力的變化被認為是檢測早期水體重金屬污染的潛在生物標志[10]，可間接反映重金屬對機體的危害程度。

大型溞(Daphniamagna)作為國際公認的毒理學實驗動物，對于維持水生生態系統的穩定具有關鍵性作用[11]。大型溞體積小而透明，具有分布廣、易于培養和生命周期短等特點，可以快速監測水體中的重金屬和有害物質的污染狀況，因此，常被廣泛用作評價水生態環境中污染物風險的模式生物[12]。目前，對大型溞的研究主要集中于環境變化對其生長繁殖的影響及其應激反應等，而重金屬鎘對大型溞腸道的毒性影響報道很少，本實驗以大型溞為實驗材料，檢測鎘對大型溞腸道結構和消化酶活力的影響，旨在探索鎘對大型溞腸道損傷的毒性機制，為水質監測提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

大型溞采自山西大學令德湖，在本實驗室經過了至少三代以上的孤雌生殖培養，其敏感度確保已經達到中國國家標準《水質、物質對溞類(大型溞)急性毒性測定方法》(GB/T13266—91)[13]的要求，在玻璃缸中置于恒溫培養箱中培養。水溫控制在(20±1) ℃，pH為7.2，溶氧量為8.0～8.3 mg·L-1，光照周期光∶暗=16 h∶8 h，小球藻(Chlorella)來源于中國科學院水生生物所，小球藻濃度為5×105cells·mL-1，投喂量為20 mL·L-1，一周投喂2～3次小球藻。實驗用水為曝氣自來水。實驗選擇大小相近、運動活潑的大型溞為材料。

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O，分析純，天津市博迪化工有限公司)；中性樹膠(北京索萊寶科技有限公司)；瓊脂粉、Bouin’s固定液、HE染液、石蠟、無水乙醇和二甲苯等為分析純，均購自上海生工生物有限公司；蛋白質濃度(Bradford法)檢測試劑盒，淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶檢測試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗設計

依據國家《地表水環境質量標準》(GB3838—2002)[14]的Ⅴ類水質的鎘濃度標準限值的1倍、5倍和9倍設置3個鎘濃度組(0.01、0.05和0.09 mg·L-1)和1個對照組，分別處理24、48 h。配制1 g·L-1鎘原液，再稀釋成相應的鎘濃度組，每組設3個平行。將實驗前選好的含卵大型溞200～300只放入2 L燒杯中正常培養，18 h后取走母溞，24 h時選擇個體大小基本一致的幼溞(一日齡)進行鎘處理和對照實驗。處理期間采取半靜態的實驗系統，與培養條件相同，24 h換水一次，每次換水50%，并維持各組鎘濃度。實驗期間不投喂食物。

1.3 腸道組織顯微與亞顯微結構的觀察

顯微結構觀察：選擇大小一致的一日齡幼溞，分別經0、0.01、0.05和0.09 mg·L-1的鎘處理24、48 h。處理期間停止喂食。各濃度組取0.1 g一日齡幼溞，用Bouin’s固定液固定16 h，2%的瓊脂預包埋，然后用乙醇進行由低到高的梯度脫水，之后用二甲苯透明處理，過夜浸蠟，常規石蠟包埋；Leica切片機連續切片，切片厚度為0.5 μm，HE染色，中性樹膠封片保存。

亞顯微結構觀察：選擇大小一致的一日齡幼溞，分別經0、0.01和0.09 mg·L-1的鎘處理48 h。處理期間停止喂食。各濃度組取0.1 g一日齡幼溞，用戊二醛固定24 h，緩沖液漂洗后用2%瓊脂預包埋，放入緩沖液中4 ℃保存，送至山西醫科大學電鏡室進行樣品處理。之后進行電鏡樣品觀察，拍照分析。

1.4 腸道消化酶活力的檢測

選取一日齡幼溞分別在染毒24、48 h后取樣，設置3個鎘濃度組(0.01、0.05和0.09 mg·L-1)和1個空白對照組。按照試劑盒提供的步驟對淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活力和蛋白質濃度進行測定，計算出具體數值。

1.5 統計分析

運用SPSS 18.0統計學軟件進行實驗數據單因素分析，結果以3個平行組的平均值±標準差(Mean±SD)來表示，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。實驗數據采用Dunnett’s檢測計算以確定最低可觀察效應濃度(LOEC)值。

2 結果(Results)

2.1 鎘對大型溞腸道組織顯微結構的影響

鎘處理大型溞24、48 h后，觀察腸道組織顯微結構的變化(圖1、圖2)。大型溞正常腸道組織的上皮細胞排列緊密，呈圓柱形且界線明顯，向腸腔內凸起形成紋狀緣(圖1(a)、2(a))。在鎘濃度為0.01 mg·L-1時，上皮細胞排列略顯松散，紋狀緣膨脹增厚(圖1(b)、圖2(b))。在鎘濃度為0.05、0.09 mg·L-1時，腸道上皮細胞界線模糊，細胞間出現斷裂，且出現空泡化，紋狀緣破裂(圖1(c)、1(d)，圖2(c)、2(d))。從圖1、圖2可以看出，隨著鎘濃度的升高和處理時間的延長，腸道上皮細胞受到的損傷程度加劇。

2.2 鎘對大型溞腸道組織亞顯微結構的影響

鎘脅迫下，大型溞腸道亞顯微結構的變化如圖3所示。對照組結果表明：腸道微絨毛形態結構正常，排列整齊規則(圖3(a))；線粒體呈規則的長橢圓形，外層膜平滑完整，內層膜折疊成規則的嵴，排列緊密，基質均勻濃厚(圖3(d))；基底膜細胞鑲嵌連接緊密，細胞間隙很小(圖3(g))；微絨毛前有完整的圍食膜，排列致密(圖3(a))。0.01 mg·L-1低濃度鎘處理組結果表明：腸道微絨毛排列疏松，開始變形、部分溶解(圖3(b))；線粒體腫脹，內部嵴結構疏松，開始出現嵴斷裂、空泡區域的現象(圖3(e))；基底膜細胞間隙連接不緊密(圖3(h))。0.09 mg·L-1高濃度鎘處理組結果表明：腸道微絨毛損傷嚴重，排列紊亂，發生溶解、破裂，甚至消失(圖3(c))；線粒體被嚴重破壞，雙層膜結構不完整，內部嵴溶解消失，空泡化嚴重(圖3(f))；基底膜鑲嵌連接間隙擴張(圖3(i))；腸道圍食膜疏松不完整，出現斷裂(圖3(c))。從對照組、低濃度和高濃度鎘處理組的大型溞腸道超微結構損傷的分析可知，高濃度鎘處理對大型溞腸道造成了更為嚴重的損傷。

圖1 鎘脅迫24 h后大型溞腸道的顯微結構注：(a)對照組；(b) 0.01 mg·L-1鎘處理組；(c) 0.05 mg·L-1鎘處理組；(d) 0.09 mg·L-1鎘處理組。Fig. 1 The changes of intestine microscopic structure of D. magna exposed to cadmium for 24 hNote: (a) control group; (b) the cadmium 0.01 mg·L-1 group; (c) the cadmium 0.05 mg·L-1 group; (d) the cadmium 0.09 mg·L-1 group.

2.3 鎘對大型溞淀粉酶活力的影響

由圖4可知，鎘處理對大型溞體內的淀粉酶活力產生了抑制作用。在處理24、48 h后各濃度組的淀粉酶活力均顯著低于對照組(P<0.01)。從圖4(a)和(b)中可以看出，24 h時大型溞在對照組和鎘處理組中的淀粉酶活力均低于處理48 h時的對照組和處理組。由表1、表2可知，鎘對大型溞腸道淀粉酶活力的LOEC為0.01 mg·L-1。

圖2 鎘脅迫48 h后大型溞腸道的顯微結構注：(a)對照組；(b) 0.01 mg·L-1鎘處理組；(c) 0.05 mg·L-1鎘處理組；(d) 0.09 mg·L-1鎘處理組。Fig. 2 The changes of intestine microscopic structure of D. magna exposed to cadmium for 48 hNote: (a) control group; (b) the cadmium 0.01 mg·L-1 group; (c) the cadmium 0.05 mg·L-1 group; (d) the cadmium 0.09 mg·L-1 group.

圖3 鎘對大型溞腸道亞顯微結構的影響注：(a)、(d)、(g)為對照組；(b)、(e)、(h)為0.01 mg·L-1鎘處理組；(c)、(f)、(i)為0.09 mg·L-1鎘處理組；MV表示微絨毛，M表示線粒體，PTM表示圍食膜，→指示細胞間隙。Fig. 3 The changes of intestine submicroscopic structure of D. magna exposed to cadmiumNote: (a), (d), (g) are figures of control group; (b), (e), (h) are figures of the cadmium 0.01 mg·L-1 group; (c), (f), (i) are figures of the cadmium 0.09 mg·L-1 group; MV stands for microvilli; M stands for mitochondria; PTM stands for the peritrophic membrane; → indicates intercellular spaces.

表1 鎘脅迫24 h后大型溞消化酶活力實驗數據統計分析表Table 1 The statistics of data of digestive enzyme activity in Daphnia magna exposed to cadmium for 24 h

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，差異顯著。

Note: *, **mean significant difference atP<0.05,P<0.01 level.

表2 鎘脅迫48 h后大型溞消化酶活力實驗數據統計分析表Table 2 The statistics of data of digestive enzyme activity in Daphnia magna exposed to cadmium for 48 h

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，差異顯著。

Note: *, **mean significant difference atP<0.05,P<0.01 level.

圖4 鎘對大型溞淀粉酶活力的影響注：(a)鎘處理24 h；(b)鎘處理48 h。Fig. 4 Effect of amylase activity of D. magna exposed to cadmiumNote: (a) cadmium treatment for 24 h; (b) cadmium treatment for 48 h.

2.4 鎘對大型溞脂肪酶活力的影響

如圖5所示，鎘處理后大型溞脂肪酶活力先升高后降低，處理24 h后在0.01～0.05 mg·L-1之間均顯著高于對照組(P<0.01)，在0.09 mg·L-1時顯著低于對照組(P<0.05)。處理48 h后，0.01～0.05 mg·L-1之間均顯著高于對照組(P<0.01、P<0.05)，且呈現下降趨勢；在0.09 mg·L-1時和對照組無顯著性差異。由表1、表2可知，鎘對大型溞腸道脂肪酶活力的LOEC為0.01 mg·L-1。

2.5 鎘對大型溞胰蛋白酶活力的影響

由圖6可知，鎘處理24 h后，濃度為0.01 mg·L-1時大型溞胰蛋白酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，濃度為0.05、0.09 mg·L-1時和對照組相比無顯著性差異。鎘處理48 h后，各濃度組的胰蛋白酶活力均顯著低于對照組(P<0.01)，且呈下降趨勢。由表1、表2可知，鎘對大型溞腸道胰蛋白酶活力的LOEC為0.01 mg·L-1。

3 討論(Discussion)

3.1 鎘對大型溞腸道結構顯微與亞顯微結構的影響

大型溞屬于濾食性動物，無專門的呼吸器官，因此，通過攝食從消化道進入和從體表經滲透作用進入是鎘入侵機體的主要方式。研究發現，鎘隨食物進入體內蓄積的量比從體表經滲透作用吸收的量高[15]，鎘進入體內后易積累在中腸，隨著循環系統輸送到全身并在各器官積累，因此，腸道是受鎘損傷的主要部位之一。早期的體外研究表明，腸道是限制鎘吸收的主要屏障，腸道屏障在遭受破壞時鎘的吸收會相應增加，表明了腸道在保護機體免受毒物損害過程中的作用至關重要[16]。腸道中的微絨毛能增加上皮游離面的吸收功能，更有利于食物的消化吸收[17]。樓哲豐等[7]研究發現，鎘可破壞果蠅(Drosophila)腸道結構的完整性，降低腸道微絨毛的高度，且造成微絨毛脫落。參環毛蚓(Pheretimaaspergillum)受到鎘脅迫后，腸道上皮細胞排列松散，微絨毛出現疏松、斷裂的現象[18]。鎘使隆線溞(Daphniacarinata)腸壁細胞的核膜破裂，核質外流，核仁變形；微絨毛溶解、變形[19]。本實驗研究結果同樣表明，鎘脅迫大型溞24 h和48 h后，隨著鎘濃度的升高，腸道上皮細胞空泡化、微絨毛脫落均很嚴重，這些結構的改變將對消化系統的功能產生嚴重的影響。

線粒體是一種能有效為細胞生命活動提供所需能量的細胞器，是細胞的“動力車間”[20]。細胞間緊密的連接能更好地發揮其滲透調節功能，對維持組織的穩態環境具有重要意義[21]。本實驗結果表明，除腸上皮細胞結構改變外，線粒體也出現嵴斷裂、空泡化，同時細胞間隙擴張。隆線溞腸道線粒體在受到鎘脅迫時會腫脹，嵴斷裂、消失[19]。其他研究也表明，動物受到脅迫后腸道細胞間隙擴張[22]。線粒體結構的改變是由于鎘脅迫后會產生過多的活性氧(ROS)，導致機體的氧化損傷[23]。前期實驗也發現，鎘脅迫后大型溞總抗氧化能力(T-AOC)隨鎘濃度的升高呈上升趨勢[24]，T-AOC是衡量機體抗氧化系統和非酶促系統功能整體狀況的綜合性指標，能消除體內多余的活性氧和自由基。因此，T-AOC的升高表明體內有過多的活性氧，從而導致氧化損傷，進一步引起線粒體結構的損傷。鎘誘導的氧化損傷也可改變Na+、K+-ATP酶活性，引起胞液中Na+的積累，從而增加細胞對水的滲透吸收，造成細胞腫脹，引起細胞排列不規則、間隙不緊密[25]。本實驗中，高濃度鎘脅迫下腸道上皮細胞出現了嚴重的細胞水樣變性，進而出現空泡化。而當大型溞受鎘脅迫后腸道屏障失去了保護機體的作用，會導致大量鎘離子通過其體壁進入體內，并存留在腸上皮，對上皮細胞也造成損傷，從而降低了腸道內表面吸取營養物質的面積，導致養分汲取的能力也隨之降低。這種破壞具有濃度依賴性，且造成的毒性可能是長期的。從而使動物的整體供能發生改變，無法進行正常的運動、攝食與消化。

圖5 鎘對大型溞脂肪酶活力的影響注：(a)鎘處理24 h；(b)鎘處理48 h。Fig. 5 Effect of lipase activity of D. magna exposed to cadmiumNote: (a) cadmium treatment for 24 h; (b) cadmium treatment for 48 h.

圖6 鎘對大型溞胰蛋白酶活力的影響注：(a)鎘處理24 h；(b)鎘處理48 h。Fig. 6 Effect of trypsin activity of D. magna exposed to cadmiumNote: (a) cadmium treatment for 24 h; (b) cadmium treatment for 48 h.

3.2 鎘對大型溞腸道消化酶活力的影響

已有研究證實，枝角類的消化道內有蛋白酶、淀粉酶和酯酶等，淀粉酶在食物的消化過程中起著重要的生物學作用，動物攝入的碳水化合物在消化道內被淀粉酶分解成單糖，然后被機體進一步吸收利用。胰蛋白酶是一種活化酶，可以把動物體內的蛋白質分解為氨基酸，然后再被機體吸收和利用。本研究發現，鎘暴露后，大型溞淀粉酶活力顯著下降，且具有濃度-效應關系；鎘處理48 h后，胰蛋白酶活力降低。這與Wu等[26]的研究結果相似，他們發現，鎘、銅脅迫河南華溪蟹(Sinopotamonhenanense)后，腸道淀粉酶和胰蛋白酶活力降低。也有研究報道，鎘脅迫三刺魚(Gasterosteusaculeatus)后，淀粉酶和脂肪酶活力降低[27]；鎘、銅等對羅非魚(tilapia)的淀粉酶和脂肪酶都有不同程度的抑制作用[28]。酶活力的降低會直接影響大分子物質的分解，消化能力變弱會降低機體對營養物質的吸收，從而影響動物體的生長發育，間接反映重金屬對動物體的危害程度。動物體內各種消化酶的發生并不是完全同步的，而是隨著機體的生長發育逐步演變和完善的，因此，腸道消化酶活力的變化與其食性和營養需求緊密相關[29]。本研究發現，對照組中48 h的大型溞腸道淀粉酶和胰蛋白酶活力比24 h的高，可能是隨著機體生長，消化器官相對增大，內分泌機能增強，消化酶活力也相應增加。在大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)生長過程中，隨著腸道的發育完善，消化酶的種類和活力大小發生著變化，蛋白酶和脂肪酶活力呈上升趨勢；淀粉酶活力呈先升后降的趨勢[29]，體現了通過消化酶活力的改變來適應不同生長階段機體對不同營養物質的需求。

水生動物對脂肪有較強的利用能力，是機體代謝過程中能量供應的有效來源，脂肪酶起著重要的分解作用。本研究發現，0.01～0.05 mg·L-1鎘對大型溞腸道脂肪酶活力具有顯著促進作用，而0.09 mg·L-1鎘對脂肪酶活力產生抑制作用，脂肪酶活力出現了“低促高抑”的現象。在鎘脅迫魚蝦后也出現了低濃度促進消化酶活力升高而高濃度抑制酶活力的現象[30]，研究鎘對泥蚶(Tegillarcagranosa)體內消化酶活力的影響時也發現，脂肪酶活力呈現“低促高抑”現象[31]。本研究中，鎘脅迫后，淀粉酶、胰蛋白酶活力都被抑制；脂肪酶呈先升高后降低的趨勢，低濃度鎘可促進脂肪酶活力增高，可能是對機體產生了“毒性興奮反應”，低濃度短時間內對脂肪的消化有促進作用；而隨著鎘濃度的升高，脂肪酶活力被抑制至低于對照組。這些酶活力的變化均表明，高濃度鎘對大型溞消化系統的結構和功能產生了損傷作用。同時，鎘對大型溞消化酶活力的LOEC為0.01 mg·L-1。與地表水中我國規定的工業廢水中鎘的最高排放濃度0.1 mg·L-1相比較而言，LOEC數值僅為標準的1/10，表明大型溞消化酶活力對水體中污染物反應靈敏，可作為鎘污染水體的檢測指標，實驗結果將為管理部門制定有關污水排放標準提供依據。另外，鎘對水生生態環境具有潛在和長遠的影響，所以必須重視對重金屬環境毒性的監測和評價。

綜上所述，高濃度鎘暴露破壞了大型溞腸道上皮細胞的顯微和亞顯微結構，對淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活力產生影響，從而對機體消化系統造成了嚴重損傷。本研究結果將為重金屬鎘對消化系統的損傷提供實驗數據，進一步為鎘抑制動物攝食提供實驗依據，同時進一步明確了水生動物在重金屬污染的水域生態環境監測中的作用，為監測水質污染、保護生態和防治鎘中毒提供理論參考與科學依據。