柱前衍生反相高效液相色譜法測定田菁種子水解液中的單糖

張倩男， 徐方敏， 連之娜， 李 鑫， 勇 強

(南京林業大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037)

田菁(Sesbaniacannabina)屬于蠶豆科，是一種耐鹽、耐澇、耐貧瘠的一年生草本植物，也是鹽堿地改良的先鋒植物，廣泛分布于我國江蘇、浙江沿海灘涂地區，同時也是優良的工業膠原料、動物飼料及秸稈綠肥[1-2]。田菁種子中含有豐富的黏性多糖物質，主要是由半乳甘露聚糖、葡聚糖以及少量木聚糖等組成。半乳甘露聚糖是一種天然水溶性多糖，由β-1,4-糖苷鍵連接的D-甘露糖骨架隨機被單個單元β-1,6- 糖苷鍵連接的D-半乳糖殘基取代，半乳甘露聚糖酶水解可制備半乳甘露低聚糖。甘露低聚糖具有增殖以雙歧桿菌為代表的腸道有益菌、改善腸道菌群結構，以及增強機體免疫力等多種生理功能[3-5]。隨著糖類分析方法的發展，目前用于分析單糖的主要色譜方法有氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法(HPLC)及高效陰離子交換色譜安培檢測法等。然而，這些分析方法都有許多缺點。比如，單糖分子需要通過復雜的過程轉化成具有高熱穩定性的揮發性衍生物，才能進行氣相色譜分析[6]。薄層色譜法[7]樣品處理繁瑣、鑒別能力不強，已逐漸被儀器分析方法所代替。高效陰離子交換色譜安培檢測法[8]在分析過程中需要使用較高pH值的流動相，對設備的要求較高。HPLC法[9]用于單糖組成分析時具有分離速度快、分辨率高、重現性好等優點，但由于單糖不吸收紫外光，無法直接使用紫外或熒光檢測器，需要經過柱前或柱后衍生化以提高HPLC的分離選擇性和檢測靈敏度。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生是在分析前使用溫和的反應條件衍生單糖，不產生立體異構產物，利用反相高效液相色譜法檢測，靈敏度高，比其他衍生方法應用更廣泛[10-11]。本研究采用柱前衍生反相HPLC法測定源于田菁種子的4種單糖，包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，以PMP為衍生化試劑，在堿性條件下與多糖水解產生的單糖定量縮合生成單糖-PMP衍生物，通過對衍生條件的優化以及色譜分離條件的考察，建立了田菁多糖的單糖組成分離測定方法，以期為單糖組分的測定提供理論指導。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

田菁種子購自中國江蘇省連云港市，樣品購買后經低溫烘干、機械粉碎后過孔徑0.150 mm篩，置于常溫通風處保存備用。半乳甘露聚糖粉末、β-甘露聚糖酶酶液(3.24 U/mL)，由南京林業大學生物化工研究所提供；微晶纖維素(纖維素質量分數為92%，纖維素結晶度為72%)，洋槐豆膠(半乳甘露聚糖質量分數為56%)，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖(分析純)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析純)，美國Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鉀、三氯甲烷(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純；其他試劑無特殊注明外，均為分析純。實驗用水為去離子水或純水。

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司； mLS-3020高壓滅菌鍋，SANYO公司；SHA-B恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；Ledend Mach 1.6R型離心機，美國Thermo Fisher公司；Classic系列超純水設備，法國ELGA LabWater公司。

1.2 標準單糖混合溶液的制備

精密稱取標準單糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)適量，溶解在含有10%甲醇的水溶液中，制備成標準單糖溶液(質量濃度均為2.0 g/L)。用去離子水適當稀釋標準單糖溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。所制備的溶液在使用前均儲存在4 ℃，避光保存。

1.3 實驗方法

1.3.1β-甘露聚糖酶酶活測定 在25 mL刻度試管中加入0.9 mL洋槐豆膠底物溶液，50 ℃預熱5 min，加入0.1 mL適當稀釋的酶液，于50 ℃下反應30 min后，立即加入3.0 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑終止反應，隨后沸水浴中處理7 min，冷卻后定容到25 mL，充分搖勻，于540 nm下測定反應混合物的吸光度，并根據吸光度與還原糖的相關關系，計算反應生成的還原糖的濃度。1個β-甘露聚糖酶活力單位(U)以每分鐘水解底物產生1 μmol還原糖(以甘露糖計)所需β-甘露聚糖酶的酶量進行計算。

1.3.2田菁種子的酶水解 稱取一定量粉碎的田菁種子粉末于酶解瓶中，加入適量的β-甘露聚糖酶，在pH值5.0、50 ℃和150 r/min下水解72 h，反應結束后，置于100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min，上清液即為酶水解液。

1.3.3半乳甘露聚糖的酸水解 稱取一定量半乳甘露聚糖樣品置于燒杯中，加入蒸餾水溶解。取1 mL 半乳甘露聚糖溶液于離心管內，加入1 mL 8%的H2SO4，于121 ℃酸水解1 h。反應結束后加入質量分數50%的NaOH溶液中和，用適量蒸餾水稀釋，即得半乳甘露聚糖酸水解液，備用。

1.3.4PMP衍生化 取標準單糖溶液、半乳甘露聚糖酸水解液和田菁種子酶水解液各150 μL，與150 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液、150 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液均勻混合，于60 ℃，80 r/min恒溫水浴鍋內反應80 min。取出，冷卻至室溫，加入150 μL 0.3 mol/L的鹽酸中和過量的氫氧化鈉至pH值為7，加水稀釋至3 mL，再加入等體積的三氯甲烷溶液，振蕩靜置，棄有機層，萃取3次，除去過量的PMP。取上層水相稀釋至適當濃度， 0.22 μm微孔濾膜過濾，進行HPLC分析。

1.4 色譜分析方法

采用Agilent 1260型高效液相色譜系統分析PMP衍生化的單糖，該系統由G1329B自動進樣器(0.1～100 μL)、G1311C四元泵、G1316A柱烘箱(273～333 K)和G1314B-UV檢測器(190～950 nm)組成。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長250 nm，進樣量10 μL。流動相A為100%乙腈，流動相B為0.02 mol/L KH2PO4緩沖溶液，梯度洗脫條件為：0 min→10 min→30 min，其中流動相A乙腈為15%→ 20%→25%。

2 結果與討論

2.1 PMP衍生化條件的優化

2.1.1PMP用量 在反應時間80 min、反應溫度60 ℃和三氯甲烷萃取次數3次的條件下，PMP用量對4種單糖衍生化的影響見圖1(a)。由圖可知，隨著PMP用量的增加，各單糖的峰面積先增加后減少。當PMP 用量為100 μL時，葡萄糖的峰面積達到最大值，而甘露糖、半乳糖、木糖在PMP用量為150 μL 時有最大峰面積。由于PMP用量過高會使單糖峰面積減少，而且會導致衍生結束后萃取不完全，浪費試劑。因此，PMP用量選為150 μL。

2.1.2反應時間 在PMP用量150 μL、反應溫度60 ℃和三氯甲烷萃取次數3次的條件下，反應時間對4種單糖衍生化的影響見圖1(b)。由圖可知，當反應時間超過40 min時，隨著反應時間的延長，各單糖的峰面積不斷增加，在反應時間為80 min時，各單糖峰面積達到最大；繼續增加反應時間，各單糖峰面積反而下降，說明反應時間的延長并不利于衍生反應的充分進行，反而導致一些不明副產物的生成[12]。因此，反應時間選為80 min。

2.1.3反應溫度 在PMP用量150 μL、反應時間80 min和三氯甲烷萃取次數3次的條件下，反應溫度對4種單糖衍生化的影響見圖1(c)。由圖可知，各單糖的峰面積隨衍生溫度的升高而逐漸增大。當溫度為60 ℃時，除葡萄糖外，各單糖峰面積達到最大，而葡萄糖在70 ℃時有最大值，繼續升高反應溫度，各單糖峰面積呈下降趨勢，這可能是由于反應中衍生產物發生分解導致峰面積下降。由于本研究主要是針對田菁種子酶解液中的甘露糖和半乳糖組成建立一種穩定的分析測定方法，因此最佳反應溫度選為60 ℃。

2.1.4萃取次數 在PMP用量150 μL、反應溫度60 ℃和反應時間80 min的條件下，三氯甲烷萃取次數對4種單糖衍生化的影響見圖1(d)。由圖可知，隨著萃取次數的增加，PMP殘留量不斷降低，當萃取次數為3次時，PMP殘留量較低，此時各單糖峰面積達到最大。繼續增加萃取次數，色譜圖上已無PMP峰，但單糖-PMP衍生物的峰面積有所減小，這是由于PMP萃取過度，造成單糖-PMP衍生物的損失。因此，三氯甲烷萃取次數選為3次。

a.PMP用量PMP dosage; b.反應時間reaction time; c.反應溫度reaction temperature; d.萃取次數extraction times圖1 不同條件對各單糖峰面積的影響Fig.1 Effects of different conditions on peak area of monosaccharide

2.2 色譜分析條件的優化

2.2.1流動相選擇 不同流動相的種類、配比、pH值等對高效液相色譜出峰的保留時間、峰形和分離度都有影響，因此選擇合適的流動相是至關重要的[13]。對比分析了乙腈/水、乙腈/乙酸、乙腈/磷酸二氫鉀和甲醇/磷酸二氫鉀4種流動相體系對4種標準單糖混合物的HPLC色譜，結果見圖2。以乙腈/水作為流動相(圖2曲線a)，色譜峰峰形較差，且葡萄糖、半乳糖、木糖未實現有效分離。乙腈/乙酸的體系雖然改善了峰形，各峰之間的分離度均大于1.5，但葡萄糖和半乳糖完全重疊(圖2曲線b)。而由圖2曲線d可知，乙腈/磷酸二氫鉀的流動相體系實現了4種標準單糖混合物的較好分離，這是由于乙腈的極性較大，洗脫能力強，實現了4種單糖的有效分離。因此，綜合考慮選擇乙腈/磷酸二氫鉀(pH值6.5)作為流動相。

2.2.2乙腈比例確定 采用C18柱進行PMP柱前衍生化高效液相色譜分析時，乙腈的比例是重要的影響因素[14]。通過調節乙腈的比例，在相同的時間梯度(0 min→10 min→50 min)條件下，設置乙腈洗脫梯度分別為15%→15%→20%(方法a)、15%→20%→25%(方法b)、15%→25%→30%(方法c)，研究對上述4種單糖保留時間及分離效果的影響，結果見圖3。由圖3可知，方法a中乙腈比例小于20%，4種單糖保留時間較長且色譜峰較寬；方法c中乙腈比例大于25%，4種單糖的保留時間較短，但分離效果較方法b降低。方法b中4種單糖的色譜峰分離度較好，分布均勻，色譜峰尖銳且對稱。因此，基于乙腈/磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.5)的流動相體系，乙腈的洗脫梯度為15%→20%→25%(0 min→10 min→30 min)，分析時間在30 min以內。

2.3 單糖PMP高效液相色譜分離

選取混合單糖標準溶液、半乳甘露聚糖酸水解液和田菁種子酶水解液進行PMP衍生化，C18反相HPLC分析其單糖組分(圖4)。

a.乙腈/水acetonitrile/water; b.乙腈/乙酸acetonitrile/acetic acid;0 min→10 min→30 min: d.乙腈acetonitrile/KH2PO4

圖2 不同流動相條件下樣品的HPLC色譜圖

Fig.2 HPLC chromatogram under different mobile phase conditions

1.PMP； 2.甘露糖mannose； 3.葡萄糖glucose； 4.半乳糖galactose； 5.木糖xylose

a.15%→15%→20%;c.甲醇methanol/KH2PO4; b.15%→20%→25%; c.15%→25%→30%

圖3 不同乙腈配比下樣品的HPLC色譜圖

Fig.3 HPLC chromatogram under different acetonitrile ratios

如圖4(a)所示，衍生試劑PMP最先出峰，對其他單糖測定結果無明顯干擾，4種單糖的衍生物在25 min內實現良好分離。通過對樣品中色譜峰保留時間與混合標準單糖溶液色譜峰保留時間的對比，半乳甘露聚糖酸水解液(圖4(b))中的單糖由甘露糖和半乳糖組成，其物質的量之比約為1 ∶0.62，與Pollard等[15]文獻報道的結果一致。圖4(c)顯示，田菁種子酶水解液主要由甘露糖和半乳糖組成，另外含有少量的葡萄糖和木糖，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的物質的量之比為1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。然而，與標準溶液色譜圖對比，田菁種子酶水解液中還存在未知色譜峰。根據還原糖衍生化后的色譜行為規律推測，這些未知色譜峰可能是寡糖[16]。

1.PMP； 2.甘露糖mannose； 3.葡萄糖glucose； 4.半乳糖galactose； 5.木糖xylose a.混合單糖標準溶液mixed monosaccharide standard solution; b.半乳甘露聚糖酸水解液acid hydrolysate of galactomannan; c.田菁種子酶水解液enzymatic hydrolysate of S. cannabina seed圖4 不同樣品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of different samples

2.4 方法學考察

2.4.1標準曲線的繪制 精密吸取一定量混合單糖標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容，配制成一系列不同質量濃度的混合溶液，在相同色譜條件下取10 μL注入高效液相色譜儀進行測定。記錄色譜圖，以單糖質量濃度(mg/L)為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，計算線性回歸方程，以3倍信噪比計算得出這4種單糖的檢測限，結果見表1。由表1可知，4種單糖的標準曲線R2均大于0.999 4。

2.4.2重復性實驗 按照1.2節方法配制質量濃度為2.0 g/L的標準混合溶液，然后根據1.3.4節方法對標準混合溶液進行衍生化后進樣，連續進樣5次，記錄各單糖每次的峰面積，計算5次所得峰面積的RSD值，結果見表2。由表2可知，4種單糖的RSD值均為0.25%左右，表明該方法的重復性良好。

表1 4種單糖線性方程和線性范圍

2.4.3穩定性實驗 按照1.2節方法配制質量濃度為2.0 g/L的標準混合溶液，然后根據1.3.4節方法對標準混合溶液進行衍生化后進樣，分別在制備后0、3、6、12和24 h后進樣，每個樣品進樣1次，記錄各單糖每次的峰面積，計算5次所得峰面積的RSD值，結果見表2。由表2可知，4種單糖的RSD值在0.07%～0.31%之間，表明標準混合溶液在24 h內穩定。

2.4.4精密度實驗 按照1.2節方法配制質量濃度為2.0 g/L的標準混合溶液，然后根據1.3.4節方法對標準混合溶液進行衍生化后進樣。在0、3、6、12和24 h分別進樣5次，記錄各單糖每次的峰面積，得到標準混合溶液的日內精密度。連續測定5 d相同條件下的日間峰面積精密度，結果見表2。由表2可知，4種單糖日內精密度的RSD值在0.09%～0.15%之間，日間精密度的RSD值在0.04%～0.41%之間，表明該方法精密度良好。

表2 各單糖重復性、穩定性和精密度實驗的RSD值(n=5)

2.4.5回收率實驗 分別精確稱取一定量的田菁種子酶水解液和半乳甘露聚糖酸水解液，定量加入標準混合溶液，測定并計算各單糖的加樣回收率以及RSD值，結果見表3。由表3可知，半乳甘露聚糖酸水解液中4種單糖的加標回收率為97.3%～103.5%，RSD值為0.82%～0.85%；田菁種子酶水解液中4種單糖的加標回收率為96.9%～104.8%，RSD值為0.24%～0.56%，表明該方法的回收率較高，準確度良好。

表3 半乳甘露聚糖酸水解液和田菁種子酶水解液的加樣回收率(n=5)

2.4.6樣品含量的測定 分別精確稱取一定量的半乳甘露聚糖酸水解液和田菁種子酶水解液，根據1.3.4節方法對各混合溶液進行衍生化后進樣，連續進樣5次，記錄各單糖每次的峰面積，取各單糖峰面積的平均值代入相應標準曲線的線性回歸方程，計算出相應的濃度及物質的量之比，結果如下：半乳甘露聚糖酸水解液中的單糖由甘露糖(0.53 g/g)和半乳糖(0.59 g/g)組成，其物質的量之比約為1 ∶0.62；田菁種子酶水解液中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖分別為0.07、0.03、0.12和0.04 g/g，物質的量之比為1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。

3 結 論

3.1通過PMP柱前衍生化高效液相色譜法，建立了利用高效液相色譜-紫外檢測器和反相C18柱分析田菁種子酶水解液中單糖的分析方法?？疾炝瞬煌V分析條件和衍生化條件對單糖衍生物峰面積的影響，結果表明：最佳的色譜分析條件為以乙腈/磷酸二氫鉀緩沖溶液(0.02 mol/L，pH值6.5)為流動相；最佳的衍生化條件為PMP用量150 μL、反應時間80 min、反應溫度60 ℃和三氯甲烷萃取3次。此條件下，各單糖組分的峰面積較大、分離效果較好。

3.2方法學考察結果發現：4種單糖組分標準曲線的R2均大于0.999 4，加標回收率為96.9%～104.8%，相對標準偏差(RSD)小于0.56%，重復性、穩定性和精密度實驗結果良好，說明該實驗條件下建立的方法有效可信。通過該方法測得田菁種子酶水解液中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的物質的量之比為1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。

3.3該方法操作簡便、快捷，重現性好，可以使樣品中4種單糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖)得到較好的分離，并可定性、定量分析田菁種子酶水解液中單糖組成及物質的量之比。柱前衍生反相高效液相色譜彌補了傳統高效液相色譜不能分離檢測木糖、半乳糖和甘露糖的不足，可望推廣應用于其他多糖的單糖組成研究。本研究結果對田菁種子酶水解液中半乳甘露低聚糖以及其他功能性低聚糖的研究具有一定的指導意義。