納米銀復合材料與抗生素的聯合抗菌性能及相關機制研究

王孟珍，孫昊宇，龍茜，林志芬

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092

抗生素被廣泛應用于醫療衛生、農業和畜牧業等領域，對感染性疾病的防治起到關鍵作用。然而，近年來抗生素的濫用使得細菌耐藥問題不斷加劇，導致抗菌劑在治療細菌感染時藥效降低甚至完全失效，這較抗菌劑自身的毒性而言對生態安全和人類健康威脅更大[1]。在此情況下，人類迫切需要開發出新的抗菌藥物以減少細菌耐藥問題。納米銀作為一種新型的抗菌藥物，其能穿透微生物的細胞壁進入細菌體內，與巰基結合后破壞細菌的呼吸鏈并產生活性氧簇抑制細菌生長[2]。相較于傳統的銀離子，納米銀具有較高的價態和巨大的比表面積，不易被氧化和沉淀，因此納米銀的使用越來越廣泛[3]。但是，單一納米銀有釋放速度快、易團聚和不穩定等缺點。為了克服這些缺點，有研究人員將納米銀與其他材料制備成納米銀復合材料，不僅能夠對納米銀起到穩定和保護作用，還能降低納米銀的釋放速度從而獲得較好的持效抑菌性能[4-5]。例如，Badu等[6]將納米銀/聚吡咯復合材料覆于棉織物上，通過瓊脂擴散板測試實驗發現，復合材料在6 h后殺滅大腸桿菌率達100%，而在12 h后殺滅金黃色葡萄球菌率達100%。Tang等[7]在氧化石墨烯的懸浮液中通過檸檬酸鈉還原硝酸銀制備得到氧化石墨烯-銀納米復合材料并進行毒性實驗，發現其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有較好的殺菌效果。因此，制備納米銀復合材料并開展其抗菌性能研究對生態安全和人類健康具有重要意義。

在納米銀復合材料的制備過程中，研究比較廣泛的納米銀載體材料有沸石[8]、碳納米管[9]、氧化石墨烯[10]以及納米二氧化硅[11]等。其中，納米二氧化硅與其他幾種載體材料相比，具有高載藥量、良好的生物相容性、低細胞毒性和高比表面積等優勢。此外，納米銀與二氧化硅載體結合的時候，既可以被包裹在二氧化硅微球的內部，也可以黏附在其外層，或者兩者同時兼具[12-14]。因此，以納米二氧化硅作為載體制備納米銀復合材料具有廣闊的應用前景。

此前關于納米銀抗菌性能的研究表明，納米銀和抗生素聯合使用可以產生協同抗菌效果[15-16]。例如，郭春蘭等[17]通過觀察傷口病原菌和耐藥菌陽性率的變化，發現納米銀敷料結合青霉素等抗生素治療慢性感染傷口具有協同抗菌作用，有助于傷口愈合。Li等[15]認為納米銀更容易與細菌細胞膜的磷脂和糖蛋白反應，可作為載體有利于阿莫西林向細胞表面運輸，從而抗菌效果更明顯。由此看出單一納米銀與某些抗生素的聯合使用可以達到協同殺菌效果，但是有關納米銀復合材料與抗生素聯合使用的抗菌性能研究卻十分有限。那么，納米銀復合材料與傳統抗生素聯合暴露是否比單一納米銀復合材料的抗菌效果好？其聯合抗菌機制又是如何？這是本文所關注的問題。

本文首先通過溶膠-凝膠法制備出二氧化硅微球作為載體材料，并參考宋笑等[18]報道的方法制備出3種不同結構的納米銀復合材料并簡單表征，最后分別測定3種納米銀復合材料對大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)的單一毒性及AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate, KS)/鹽酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride, OH)對受試菌的二元聯合毒性。本文旨在得到具有良好抗菌性能的納米銀復合材料，并探索可以產生協同抗菌作用的納米銀復合材料與抗生素的組合，為開發新型抗菌材料提供思路并為其進一步推廣使用提供參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

正硅酸四乙酯、氨水(25%～28%)、無水乙醇、甲醇、甲醛和鹽酸(36%～38%)均購自國藥集團化學試劑有限公司(上海，中國)，純度均為分析純。多巴胺鹽酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化銨和硝酸銀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海，中國)，純度均為分析純。鹽酸土霉素和硫酸卡那霉素購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司(上海，中國)，純度為分析純以上。

本實驗中使用的模式生物E.coli(K-12 MG1655)和B.subtilis(168)購自BioVector科技有限公司(北京，中國)。

1.2 納米銀復合材料的制備

1.2.1 納米二氧化硅(SiO2)的制備

將9 mL的氨水與24.75 mL的去離子水及16.25 mL的無水乙醇混勻得到溶液A；將4.5 mL的正硅酸四乙酯與45.5 mL的無水乙醇混合，用85-1型磁力攪拌器(武漢科爾儀器有限公司，武漢，中國)以1 100 r·min-1轉速攪拌20 min，得到溶液B。室溫下將B溶液快速加入A溶液中，60 s后將攪拌速度降低至350～400 r·min-1。反應2 h后將溶液進行離心，去掉上清液，沉淀物用乙醇反復洗滌3次后，用DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏儀器有限公司，上海，中國)干燥，得到納米SiO2粒子。

1.2.2 納米銀@二氧化硅(AgNPs@SiO2)的制備

將0.2 g的十六烷基三甲基溴化銨、96 mL的去離子水和2.8 mL的氨水加入到三口燒瓶中，不斷攪拌，加熱至80 ℃后反應30 min。此時向燒瓶中加入1 mL的硝酸銀溶液(0.1 mol·L-1)和0.6 mL的甲醛溶液(1.0 mol·L-1)，攪拌5 min后，向混合體系逐滴滴加1 mL的正硅酸四乙酯。反應2 h后將溶液進行離心，去掉上清液，沉淀物用去離子水洗滌后加入80 mL的0.1 mol·L-1的鹽酸/乙醇溶液，在80 ℃條件下加熱回流4 h后，將溶液進行離心，去掉上清液，將沉淀物真空干燥后得到AgNPs@SiO2粒子。

1.2.3 二氧化硅-聚多巴胺-納米銀(SiO2-PD-AgNPs)的制備

將50 mL 0.1 mol·L-1的三羥甲基氨基甲烷溶液與14.7 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸混合，加水定容至100 mL，得到pH=8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液。將0.06 g的多巴胺鹽酸鹽和0.05 g的SiO2顆粒加入30 mL三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，室溫下避光攪拌過夜。將反應產物過濾洗滌后，加到20 mL的硝酸銀(1.5 mg·mL-1)溶液中，氮氣保護下80 ℃反應30 min。將溶液進行離心，去掉上清液，沉淀物用乙醇反復洗滌3次后真空干燥，得到SiO2-PD-AgNPs粒子。

1.2.4 納米銀@二氧化硅-聚多巴胺-納米銀(AgNPs@SiO2-PD-AgNPs)的制備

將SiO2-PD-AgNPs制備過程中的SiO2替換為AgNPs@SiO2，按照同樣的方法反應合成AgNPs@SiO2-PD-AgNPs粒子。

1.3 毒性測定及表征方法

1.3.1 受試菌的培養

液體培養基配方為10.0 g·L-1氯化鈉、25.0 g·L-1蛋白胨和12.5 g·L-1酵母膏，pH調節至約為7.0。取E.coli或B.subtilis菌種接種到5 mL液體培養基中，在37 ℃恒溫條件下震蕩培養(E.coli為6 h，B.subtilis為10 h)至對數生長期，將菌液用1%氯化鈉溶液稀釋105倍，用于毒性測定。

1.3.2 毒性實驗

稱取待測樣用1%氯化鈉溶液配制成母液，將母液用1%氯化鈉溶液稀釋成等對數梯度的濃度加入96孔板中。每孔溶液總體系為200 μL，其中包括80 μL培養基、40 μL工作菌液以及80 μL待測物質溶液，每個濃度梯度設置3個平行，37 ℃下180 r·min-1震蕩培養(E.coli培養12 h，B.subtilis培養19 h)，使用GO1510型多功能酶標儀(Thermo Fisher公司，沃爾瑟姆，美國)測定600 nm處的光密度值(OD600)。根據式(1)計算測試樣對細菌的抑制率。

(1)

式中：OD600,0為受試菌在無染毒作用下的空白OD600讀數的平均值；OD600,i為受試菌在濃度為i的化合物作用下OD600讀數的平均值。以測試樣濃度的負對數為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制劑量-效應曲線，50%抑制率時對應的測試樣濃度即為半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)。

EC50是一個經典參數，已在毒理學研究中長期使用。作為衡量物質生物毒性大小的指標，EC50值越小表示物質的毒性越大[19]。根據單獨毒性實驗研究中每種抗菌劑對受試菌的EC50濃度值來確定配制測試樣A(納米銀復合材料，本研究中選用AgNPs@SiO2-PD-AgNPs進行聯合毒性實驗)與測試樣B(KS/OH)的混合溶液濃度，按照AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS/OH的EC50配制系列二元混合溶液，其毒性比分別為1∶1、1∶5和5∶1。然后按照單一毒性測定方法測定系列混合溶液的聯合毒性，并繪制劑量-效應曲線，計算出EC50mix。EC50mix和毒性單位(toxic unit, TU)都是用來表征混合毒性效應的重要參數，TU法參數的物理意義比較明確，計算簡捷，評價結果便于理解，用此模型來判斷混合物的聯合作用結果較為可靠，可以直觀地判斷出混合毒性的聯合效應類型，因此得到廣泛的應用[20]。聯合毒性的研究是依據單一測試樣的EC50來設計的，將單一測試樣對受試菌的抑制率為50%時對應的濃度定義為一個毒性單位[21]，實驗所得聯合毒性效應使用的TU的計算如式(2)。

(2)

式中：CA、CB是混合體系產生50%抑制時測試樣A、B各自的濃度，EC50A和EC50B是測試樣A、B分別作用于細菌時產生50%抑制時的濃度。當TU<0.8時，判定聯合毒性效應為協同；當0.8≤TU≤1.2時，判定聯合毒性效應為相加；當TU>1.2時，判定聯合毒性效應為拮抗[22]。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 納米銀復合粒子的表征

使用ZEN3690型粒度分析儀(Malvern公司，馬爾文，英國)對復合材料的粒徑以及分散系數進行分析，結果如表1所示。AgNPs@SiO2的粒徑是553.7 nm，分散系數為0.725；SiO2-PD-AgNPs的粒徑是743.6 nm，分散系數為0.547；AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的粒徑是974.6 nm，分散系數為0.392?？梢?，3種納米銀復合材料的粒徑大小排序為：AgNPs@SiO2-PD-AgNPs>SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2，其中AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的分散系數最小，其分散度最好。

此外，用Evolution 350型紫外可見分光光度計(Thermo Scientific公司，沃爾瑟姆，美國)檢測3種納米銀復合材料的紫外吸收光譜。結果如圖1(a)所示，AgNPs@SiO2無紫外吸收，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs在475 nm左右產生了最大紫外吸收峰。已有研究表明，納米銀的最大紫外吸收峰在420 nm左右[23-24]，所以筆者推測475 nm左右處的最大紫外吸收峰很可能與復合材料中的納米銀有關。對于AgNPs@SiO2，在其制備過程中，甲醛作為還原劑還原硝酸銀為納米銀，納米銀被包覆于SiO2微球的孔洞中，因此沒有明顯的紫外吸收峰，推測其結構如圖1(b)所示。而在SiO2-PD-AgNPs的制備過程中，多巴胺會聚合成為聚多巴胺并在SiO2表面形成一層薄膜，隨后聚多巴胺還原硝酸銀為納米銀后被包覆在聚多巴胺薄膜外面，因此可以檢測到紫外吸收峰，其推測結構如圖1(b)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs結合了前面2種復合材料的特點，SiO2內層和表面都存在納米銀粒子，具有明顯的夾心層結構，所以也會出現紫外吸收峰，推測結構如圖1(b)所示。此外，納米銀最大吸收峰的位置和形狀在很大程度上取決于其粒徑、表面吸附的物質以及周圍的電介質[25-26]。在AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs這2種復合材料中，由于SiO2的折射率略高于水，納米銀與SiO2的結合導致納米銀周圍基質的介電常數與折射率都有所增加，因此，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs的最大紫外吸收峰(475 nm左右)相對于納米銀的最大紫外吸收峰(420 nm左右)發生了紅移。

表1 納米銀復合材料的粒徑和分散系數Table 1 Particle size and polymer dispersity index of nanosilver composites

注：AgNPs@SiO2為納米銀@二氧化硅復合材料，SiO2-PD-AgNPs為二氧化硅-聚多巴胺-納米銀復合材料，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs為納米銀@二氧化硅-聚多巴胺-納米銀復合材料。

Note: AgNPs@SiO2stands for nanosilver@silica; SiO2-PD-AgNPs stands for silica-polydopamine-nanosilver; AgNPs@SiO2-PD-AgNPs stands for nanosilver@silica-polydopamine-nanosilver.

2.2 單一毒性

3種納米銀復合材料對E.coli和B.subtilis的單一毒性數據如表2所示。由實驗結果可知，AgNPs@SiO2、SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs對E.coli的EC50分別為65.7、90.7和48.2 mg·L-1，對B.subtilis的EC50分別為466.4、560.0和161.5 mg·L-1?？梢?種納米銀復合材料對2種菌的毒性大小順序一致，均為AgNPs@SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2>SiO2-PD-AgNPs。

此前，已有研究闡明納米銀復合材料主要依靠納米銀和Ag+進入細胞內阻斷DNA復制和產生活性氧誘導細胞凋亡來殺死細菌[27]。根據納米銀復合材料抗菌機理的相關研究[28]，以AgNPs@SiO2為例，推測其抗菌機理如圖2(a)所示。AgNPs@SiO2吸附在細菌表面，在與細胞接觸的過程中，納米銀粒子通過硅殼孔道釋放出來(如圖2(b))，納米銀可能會影響細胞壁上的某些蛋白質和磷脂，誘導膜破裂，影響細胞膜的完整性[29-30]，從而使細胞膜通透性增加，進而導致細胞內容物釋放。在此過程中，納米銀會釋放出Ag+[29,31]。納米銀和Ag+進入到胞內，一方面導致活性氧簇(ROS)的產生，Ag+被氧化為Ag2O，從而滅活呼吸鏈脫氫酶，抑制細胞呼吸；另一方面Ag+通過與細菌蛋白酶上的巰基(—SH)迅速結合，破壞蛋白質的三維結構，抑制細菌生命活動必需的酶和蛋白質的活性[32]，并通過濃縮DNA使其失去復制能力而引起DNA的降解來抑制細菌的生長繁殖[33]，最后達到抑菌效果。SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的納米銀和Ag+的釋放過程如圖2(c)和圖2(d)所示。對于SiO2-PD-AgNPs，因為納米銀粒子覆蓋在最外層，所以在與細菌接觸的過程中直接釋放。由于AgNPs@SiO2-PD-AgNPs具備前面2種材料的特點，因此其最外層的納米銀先流失，然后聚多巴胺膜被水解破壞，最后SiO2內部的納米銀被釋放出來。在納米銀釋放之后，SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的抗菌機制與AgNPs@SiO2類似。

圖1 3種納米銀復合材料的紫外可見吸收光譜(a)與結構(b)注：1. AgNPs@SiO2-PD-AgNPs；2. SiO2-PD-AgNPs；3. AgNPs@SiO2。Fig. 1 UV-vis spectra (a) and the structure (b) of three kinds of nanosilver compositesNote: 1. AgNPs@SiO2-PD-AgNPs; 2. SiO2-PD-AgNPs; 3. AgNPs@SiO2.

表2 3種納米銀復合材料的半最大效應濃度(EC50)Table 2 The concentration for 50% of maximal effect (EC50) of three kinds of nanosilver composites (mg·L-1)

本研究中納米銀復合材料的抗菌性能主要由納米銀的負載率決定。對于AgNPs@SiO2來說，該材料是將納米銀的還原反應和正硅酸乙酯的水解反應同時進行，使納米銀能夠更多地被包裹于SiO2微孔中，其對納米銀的吸附率較高。而SiO2表面的聚多巴胺雖具有一定的黏附性，但其負載的納米銀粒子可能相對較少，導致SiO2-PD-AgNPs毒性較AgNPs@SiO2小。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs是在AgNPs@SiO2的基礎上，對材料表面進行進一步修飾，從而進一步提高了納米銀的負載率，因此AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的毒性最大。從受試菌來看，3種材料對E.coli的毒性均大于對B.subtilis的毒性，即E.coli對納米銀復合材料的敏感度要遠遠高于B.subtilis。筆者推測這可能與2種菌的細胞壁結構有關：E.coli是革蘭氏陰性菌，細胞壁結構較為單薄，含極少肽聚糖，納米銀和Ag+容易滲透到細胞質中；對于B.subtilis來說，細胞壁堅固致密的肽聚糖層會阻礙納米銀和Ag+的滲透，抑菌效應減弱[34]。

圖2 3種納米銀復合材料的抑菌機理注：ROS表示活性氧簇；—SH表示巰基。Fig. 2 Bacteriostatic mechanism of three nanosilver compositesNote: ROS stands for reactive oxygen species;—SH stands for hydrosulfuryl.

2.3 聯合毒性

為了探究納米銀復合材料與抗生素的聯合抗菌性能，本研究選用單一毒性最大的AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與廣泛應用的抗菌藥物KS/OH進行二元聯合[35-37]，測定二元混合物對E.coli和B.subtilis的聯合毒性，結果如表3所示?？梢?，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時對E.coli的聯合毒性效應為協同，對B.subtilis的聯合毒性效應為相加，而AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與OH在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時對2種菌的聯合毒性效應均為相加。

以往的研究指出納米銀與抗生素產生協同抗菌效應的可能原因是由于抗生素分子包含許多活性基團，例如羥基和酰胺基(圖3(a))，它們容易與納米銀通過鍵合反應成為抗生素-納米銀復合物[24,38]。本研究中，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS在3種不同濃度配比下對E.coli都可以產生協同效應，表明二者的協同效應不會受濃度配比的影響。筆者推測納米銀復合材料和KS對E.coli的協同作用機理如圖3(b)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs首先釋放出納米銀粒子(圖2(d))，KS和納米銀通過鍵合反應成為KS-納米銀復合物，納米銀與KS的結合會使納米銀的有效表面積發生變化，影響Ag+的釋放動力學[39]，所以KS-納米銀復合物比相同條件下單獨納米銀作用釋放了更多的Ag+。Ag+從復合物中的釋放一方面增加了細胞膜的通透性，另一方面也導致KS從復合物中解離下來[40-41]。因此，納米銀復合材料與KS聯合作用使得進入細菌體內的Ag+和KS含量均大于單獨作用時可進入胞內的抗菌劑含量。進入胞內的Ag+導致ROS的產生從而使Ag+被氧化為Ag2O，滅活呼吸鏈脫氫酶，抑制細胞呼吸，并且Ag+通過與細菌細胞內的蛋白質和DNA分子結合從而引起細菌毒性[29]；而KS通過結合于細菌的30S核糖體影響細菌蛋白質的正常合成，進而破壞細菌功能導致E.coli死亡[42]。因此，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS對E.coli表現出協同抗菌效應。而B.subtilis是革蘭氏陽性菌，其細胞壁較厚(平均20～80 nm)，從內向外有15～50層含量豐富的肽聚糖，結構致密，所以相較于E.coli，其細胞膜通透性不易被改變，筆者推測這可能是AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS二元聯合對B.subtilis表現出相加效應的原因。

對于AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和OH的聯合毒性效應，有研究指出，納米銀與四環素在水溶液中共存時會發生交互反應，改變納米銀與四環素的理化性質，導致Ag+的濃度升高，四環素的濃度降低[43]。Wan等[44]在評價納米銀與抗生素聯合抑制大腸桿菌實驗中也發現，納米銀與四環素聯用不具有協同抑菌效果。因此，筆者推測納米銀復合材料和OH的聯合作用機制如圖3(d)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs首先釋放出納米銀(圖2(d))，之后OH通過羥基和酰胺基(圖3(c))與納米銀結合成為OH-納米銀復合物。但是OH與納米銀會發生交互反應，改變了OH與納米銀的理化性質，導致Ag+濃度增加，OH濃度降低。一方面，OH-納米銀復合物會釋放更多的Ag+，與單獨的納米銀相比會對細菌產生更大的毒性作用；另一方面，OH濃度的降低減少了其與細菌核糖體的結合，降低了對蛋白質合成過程的影響，和相同條件下單獨的OH作用相比對細菌的毒性效應減弱了，總體表現出對細菌的聯合抗菌效應為相加。

圖3 AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與2種抗生素的聯合抗菌機理Fig. 3 Combined antibacterial mechanism of AgNPs@SiO2-PD-AgNPs and two antibiotics

表3 抗菌混合物的聯合毒性作用Table 3 The joint toxic action of antimicrobial mixture

綜上，本文制備出3種納米銀復合材料并對其抗菌性能進行探究，研究結果總結如下。(1)3種納米銀復合材料對細菌的單一毒性大小順序一致，均為AgNPs@SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2>SiO2-PD-AgNPs。此外，E.coli對納米銀復合材料的敏感度要高于B.subtilis。(2)AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時對E.coli的聯合毒性效應為協同，對B.subtilis的聯合毒性效應為相加，而AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與OH對2種菌的聯合毒性效應均為相加。(3)AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS協同效應產生的主要原因可能是因為二者結合而成的KS-納米銀復合物導致進入細菌體內的Ag+和KS相較于單獨的抗菌劑作用時均有增加，對細菌產生更大的毒性作用，表現出協同抗菌效應。因此，可以推測AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS聯用會對革蘭氏陰性菌發揮優異的協同抗菌性能。所以，建議在今后的實際運用中，可以將夾心層結構的納米銀復合材料和包含有羥基和酰胺基等活性基團并且不會與納米銀發生交互反應的抗生素聯合作用于革蘭氏陰性菌；此外，在此基礎上有必要進一步探究對革蘭氏陽性菌也能產生良好協同抗菌效應的納米銀復合材料與抗生素的組合，為開發新型抗菌材料提供新思路并為聯合用藥提供參考。