全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)對半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)免疫相關基因表達的影響

汪笑宇，戴媛媛，賈磊，王群山，陳春秀

天津渤海水產研究所，天津 300457

全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulfonate, PFOS)有穩定的C—F化學結構，具有化學穩定性高、耐熱性高和表面活性高的特點，是一種持久性有機污染物。PFOS作為表面活性制劑在工業以及民用領域應用十分廣泛，例如紡織業、皮革、食品包裝和洗滌劑等。這些產品的大量使用使PFOS以各種途徑進入到環境及生物體內，并通過食物鏈逐級累積傳遞。

海洋是PFOS類污染物的最終歸宿[1]。近年來，世界多地的海水和海洋生物體內不斷檢出PFOS。Gulkowska等[2]測得來自廣東省和浙江省的包括魚類、螃蟹、小蝦、牡蠣、蚌和蛤等27個海洋樣品中，PFOS濃度范圍為0.3～13.9 ng·g-1濕重。近年來，毒理學研究表明，PFOS進入生物體內能夠影響基因表達，改變生物酶活性，導致胚胎發育畸形，致使生物體重下降，影響膽固醇水平等[3-7]。長期暴露于低濃度PFOS中，可導致斑馬魚胚胎脊柱畸形，大型蚤(Daphniamagna)的繁殖受到抑制[8]，使黃海膽(Glyptocidariscrenulares)DNA甲基化水平升高[9]等。Houde等[10]還發現處于相對較高營養級的動物體內PFOS濃度較高。這說明，水環境和水生生物體內的PFOS可通過食物鏈的傳遞和生物富集作用影響到更高營養級生物，威脅人類的健康。因此，各國相繼出臺了各種措施限制禁止了PFOS類物質的使用[11]，PFOS也迅速成為近年來人們關注的熱點[12]。

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)生長快，適應范圍廣，營養價值高，近年來已成為增殖放流和人工養殖的最佳品種之一；在我國的黃渤海、東海和南海均有分布，以渤海、黃海海域為多[13]，是一種典型的近岸海洋海區魚類。目前，對半滑舌鰨的研究主要集中在各種環境因子對其生長發育的影響[14-15]，以及各種金屬離子對半滑舌鰨的毒性作用方面[16]。黨紅蕾等[17]從細胞水平研究了PFOS對半滑舌鰨肝細胞的毒性效應，表明PFOS對半滑舌鰨肝細胞具有一定的生物毒性。

本實驗以半滑舌鰨為研究對象，首次從基因表達水平上，運用RT-PCR分析半滑舌鰨熱休克蛋白70(heat shock 70kDa protein1,hsp70)、熱休克蛋白90(heat shock 90kDa protein,hsp90)、C型凝集素(c-type lectin domain,c-typelectin)和細胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase,cox)等4種免疫相關基因在半滑舌鰨不同組織器官中隨時間的表達變化，從mRNA轉錄水平上探討PFOS對半滑舌鰨的毒性影響。為研究PFOS污染對健康養殖和海洋生態環境的影響，以及保護重要水產經濟種類提供更多的理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

半滑舌鰨幼魚取自天津市興盛海淡水養殖有限責任公司。實驗魚體長范圍為12～16 cm，6月齡，在實驗室暫養一周以上，暫養期間無死亡。實驗前一天停止投餌。選擇體型正常，反應靈敏，大小基本一致，外觀無異?，F象的幼魚進行隨機分組。

1.2 主要試劑及儀器

全氟辛烷磺酸鉀(C8F17KO3S)，純度為AR級(Sigma公司，美國)，溶解于純度>99%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海生工)，配成濃度為10 g·L-1的母液，使用時稀釋成所需要的濃度。

Trizol(Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia公司)，Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG(Life Technologies公司)，其他試劑均為國產分析純。

Epgiadients PCR儀(Eppendorf，德國)，ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Life Technologies公司，美國)

1.3 染毒與取樣方法

根據預實驗結果，實驗濃度設置為2 mg·L-1，設置3個平行組，同時設有DMSO對照組。實驗容器為40 L透明玻璃缸，每缸水量25 L，放入半滑舌鰨幼魚6～10尾，供試海水取自自然海水，經沉淀池沉淀和砂濾后待用。實驗期間海水pH值為7.6～8.0，溫度18～22 ℃。實驗過程中晝夜曝氣，每天換水1/2。實驗期間各組未出現死亡現象。

實驗中分別于24 h、48 h、96 h和7 d取出半滑舌鰨的肝、鰓、腸和肌肉組織，每次每個時間點隨機取出5尾，其中將3尾魚的組織隨機合成一個樣本進行測定，每個時間點共有3個平行樣本。組織取出后，用預冷的0.9%生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后裝袋密封，放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.4 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出后于冰上融化，按Trizol試劑說明書提取總RNA，電泳檢測完整性，核酸定量儀檢測其濃度和純度，保證其OD260/OD280=1.8～2.0。利用DNaseI處理RNA，去除殘留的基因組DNA污染。

以總RNA(約1 μg)為模板，按照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (GeneCopoeia Cat. No. AORT-0050)說明書對各組織的總RNA進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。反應產物4 ℃備用，或者-20 ℃保存。

1.5 引物設計及熒光定量PCR擴增

1.5.1 引物設計

根據NCBI數據庫上半滑舌鰨的相關基因序列，分別設計各基因的熒光定量PCR引物，相關基因包括hsp70、hsp90、c-typelectin和cox。選擇基因穩定表達及片段大小合適的β-actin(putative beta-actin,β-actin)為內參基因。具體序列與產物大小如表1所示。

1.5.2 熒光定量PCR擴增

按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒說明書進行操作，在熒光定量儀ABI 7500 Fast Real-Time PCR system上進行熒光定量PCR擴增。反應體系為20 μL，含cDNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL(終濃度為0.2 μmol·L-1)，SYBR?Green qPCR SuperMix(2×)10 μL，以ddH2O補足體積。PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；循環條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，PCR循環40。擴增結束后進行熔解曲線分析，確定PCR質量，熔解曲線條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

相對定量參考Livak和Schmittgen的方法[18]，運用2-△△CT法計算目的基因的表達倍數，△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組。

采用SPSS 23.0軟件對組間數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05、P<0.01表明差異顯著。所有結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果(Results)

在PFOS暴露期間，各對照組和實驗組均無實驗魚死亡及行為異常，說明實驗濃度范圍內PFOS對半滑舌鰨無可觀測的急性毒性作用。

2.1 PFOS暴露下hsp70 mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對表達量分析

PFOS暴露對半滑舌鰨不同組織hsp70 mRNA表達的影響如圖1所示。半滑舌鰨hsp70 mRNA相對表達量在各組織中幾乎均上調。半滑舌鰨肝組織中hsp70 mRNA相對表達量高于對照組，在24 h達到峰值(P<0.05)，隨后呈現下降趨勢，至7 d時已基本恢復至對照組水平(P>0.05)(圖1(a))。鰓組織hsp70 mRNA表達量呈現先升高、再下降的趨勢，在48 h達到峰值(P<0.05)，至7 d時與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖1(b))。腸組織中hsp70 mRNA表達量在48 h內與對照組并無顯著差異(P>0.05)，96 h升高達到最高值(P<0.05)，隨后呈現下降趨勢。肌肉組織hsp70 mRNA的相對表達量呈現先下降后升高的趨勢，48 h降至最低(P<0.05)，96 h升高至峰值(P<0.05)，隨后7 d時回落至對照組水平(P>0.05)。

表1 實驗所用的引物序列Table 1 Primers used for all the expriments

2.2 PFOS暴露下hsp90 mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對表達量分析

PFOS暴露對半滑舌鰨不同組織hsp90 mRNA表達的影響如圖2所示。肝組織中hsp90 mRNA的表達量與對照組相比呈顯著性差異(P<0.05)，呈現先降低后升高，再降低的趨勢，在48 h達到最高值(P<0.05)(圖2(a))。鰓組織hsp90 mRNA表達量48 h和7 d時與對照組呈顯著性差異(P<0.05)(圖2(b))。腸組織hsp90 mRNA表達量呈現先上升后下降的趨勢，在48 h和96 h達到頂峰，7 d后與對照組無顯著差異(P>0.05)。肌肉組織hsp90 mRNA表達量與對照組相比呈現顯著下調(P<0.05)。

2.3 PFOS暴露下c-type lectin mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對表達量分析

PFOS暴露對半滑舌鰨不同組織c-typelectinmRNA表達的影響如圖3所示。隨著PFOS暴露時間的延長，各組織中c-typelectinmRNA表達量均呈下調表達或表達水平不變。肝組織中c-typelectinmRNA表達呈下調趨勢，在24 h下降至最低點，隨后48 h～7 d時恢復至對照組水平(P>0.05)(圖3(a))。鰓組織中c-typelectinmRNA呈下調表達，其表達量呈現先下降再升高，再下降的趨勢，在7 d時達到最低值，與對照組相比呈顯著差異(P<0.05)(圖3(b))。腸組織中c-typelectinmRNA表達量與對照組沒有明顯差異(P>0.05)(圖3(c))。肌肉組織中c-typelectinmRNA各時間段表達量下調(P<0.05)，其相對表達量在48 h達到最低值(圖3(d))。

圖1 半滑舌鰨不同組織熱休克蛋白hsp70 mRNA表達量隨全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)暴露時間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Changes of hsp70 mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to perfluorooctane sulfonate (PFOS)Note: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

圖2 半滑舌鰨不同組織hsp90 mRNA表達量隨PFOS暴露時間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Changes of hsp90 mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

2.4 PFOS暴露下cox mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對表達量分析

PFOS暴露對半滑舌鰨不同組織coxmRNA表達的影響如圖4所示。隨著PFOS暴露時間的延長，肝組織中cox基因表達下調，其24 h和48 h的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)，96 h時coxmRNA表達量恢復至對照組水平(P>0.05)(圖4(a))。鰓組織中coxmRNA表達量呈現先升高再降低的趨勢，48 h時coxmRNA表達量升至最高點，與對照組差異顯著(P<0.05)(圖4(b))。腸組織中coxmRNA表達出現下調，其相對表達量在24 h和48 h顯著低于對照組(P<0.05)，在96 h恢復至對照組水平(P>0.05)(圖4(c))。肌肉組織中coxmRNA表達量在24 h與對照組差異顯著(P<0.05)，隨后于48 h和96 h回落至對照組水平(P>0.05)(圖4(d))。

3 討論(Discussion)

目前，PFOS的毒性作用機制雖尚未完全闡明，但大量研究表明，PFOS能引起多種生物的基因轉錄表達發生變化[19-22]。本實驗選擇了hsp70、hsp90、c-typelectin和cox等4種可能與PFOS免疫毒性相關的基因，其中，hsp70和hsp90屬于熱休克蛋白家族，是生物體應對外界壓力的標志性基因；c-typelectin是固有免疫系統中的重要模式識別受體；cox是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，其基因表達量變化可以直接反映出受到外界壓力時機體的能量運轉情況。本研究通過RT-PCR技術檢測PFOS暴露24 h、48 h、96 h和7 d后，半滑舌鰨各組織中基因表達的變化，初步探討PFOS對半滑舌鰨的免疫毒性作用。

熱休克蛋白的主要功能是維持生物體內環境的穩態。當機體暴露在重金屬、有機物和高溫等惡劣條件下，機體發生應激反應，熱休克蛋白會大量表達，從而幫助機體每個細胞維持正常的生理活動，阻止影響細胞健康的蛋白質相互作用[23-24]。San-segundo等[19]認為hsp70的激活可以由化學物質和蛋白質之間的直接相互作用產生，也可以由氧化應激、離子穩態或能量代謝抑制劑引起的細胞氧化還原狀態的擾動所造成的損傷而產生。因此，PFOS作為hsp70誘導劑，可能直接或間接與熱休克蛋白發生相互作用，誘導hsp70的大量表達。筆者推測PFOS進入機體細胞后，通過與熱休克轉錄因子結合，使hsp70基因第一時間被激活并大量表達，為機體提供了主要的防御機制。具體的結合及調節機制還需進一步的證實。

圖3 半滑舌鰨不同組織c-type lectin mRNA表達量隨PFOS暴露時間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 3 Changes of c-type lectin mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

研究表明，魚類肝臟是PFOS的主要富集場所[20]。在本實驗中，hsp70基因在肝組織中的相對表達在24 h達到峰值，達到對照組的23倍左右，表達高峰值的出現也早于其他組織，這表明，肝組織對PFOS脅迫反應較為靈敏，在受到應激反應后迅速啟動了hsp70基因的表達。Kr?vel等[20]也發現類似現象，將大西洋鮭的肝細胞體外分離后，將其暴露于15 mg·L-1的PFOS中24 h后，hsp70 mRNA表達量顯著增加。PFOS還能夠引起肝細胞結構和細胞膜的交互功能損傷[25-27]。因此，在受到PFOS脅迫后，肝是發生免疫應激反應的主要器官，在應對有毒物質入侵的免疫反應中占據重要地位。

通過實驗數據發現，半滑舌鰨鰓、腸和肌肉中的hsp70基因的相對表達在48 h或96 h達到峰值，表達量是對照組的2～5倍左右。而在長時間受到PFOS脅迫后，hsp70基因的表達都呈現下降趨勢，肝、鰓和肌肉組織在PFOS脅迫7 d時hsp70基因表達量均已恢復至對照組水平，推測當脅迫時間超過一定限度時，魚體免疫功能逐漸下降，從而導致hsp70表達慢慢回落；也可能是hsp70只參與了魚類機體對抗有毒物質的應急機制，隨著脅迫時間的延長，機體啟動另一套免疫機制來對抗有毒物質的入侵。東亞三角渦蟲[28]和大西洋鮭[20]的暴露實驗結果也表明，暴露于PFOS中24 h后，hsp70 mRNA表達顯著上升，暴露于PFOS中48 h后，其表達量明顯下降，與本實驗的研究結果一致。

圖4 半滑舌鰨不同組織cox mRNA表達量隨PFOS暴露時間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 Changes of cox mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

熱休克蛋白hsp90在進化上高度保守，廣泛分布于從原核到真核的各類生物體內，在水生動植物的誘導表達研究中發現，hsp90可以參與水生動植物對熱激和冷激、高鹽和低鹽以及對低溶氧的耐受，還參與了疾病防御、發育調控等方面的生理過程[29]。本研究中，hsp90在半滑舌鰨肝、腸中均呈現了先升高再降低的趨勢，在48 h達到最大值，7 d后恢復至對照組水平。在脅迫條件下，hsp90通過降解變性蛋白和運送蛋白質而保護有機體免受不利環境脅迫傷害，因此，hsp90基因表達升高是機體對脅迫導致的變性蛋白質增多做出的響應。隨著脅迫時間進一步延長，機體組織細胞受到損傷，降低了正常細胞的代謝能力，導致了hsp90表達降低。鰓組織中hsp90基因的相對表達量在7 d后達到峰值，可能是由于全氟化合物具有生物積累作用，隨著積累量的增加，hsp90在7 d后表達才達高峰，一定程度上反映了PFOS積累量與鰓組織免疫機能的關系。肌肉組織hsp90基因的相對表達受到抑制，這可能與基因表達的組織特異性有關，肌肉組織不是關鍵的免疫器官，因此，在機體受到PFOS脅迫時，體內的轉錄調節體系優先上調或正常表達免疫相關的組織中的hsp90基因。

本研究結果也表明，hsp70和hsp90基因在半滑舌鰨各組織中出現時序性表達，肝組織中hsp70和hsp90達到最大值的時間點分別是24 h和48 h，hsp90較hsp70延遲；鰓組織中hsp70在48 h達到峰值，而hsp90在7 d后再次上升至峰值；腸組織中達到峰值的時間分別是96 h和48 h，hsp70較hsp90延遲。這表明，hsp70和hsp90雖都是熱休克蛋白家族的成員，但在半滑舌鰨受到PFOS脅迫過程中，它們在不同組織中的響應機制完全不同。本研究中，同一基因在不同組織的表達具有一定的組織特異性，這與組織的功能定位及基因參與不同的免疫通路等有關，具體的調節機制還有待進一步研究。

c-type lectin是一類具有糖識別結構域(carbon hydrate recognition domain, CRD)的蛋白超家族，在進化中存在高度保守序列，作為模式識別蛋白參與了眾多動物的先天免疫[30-34]。目前，關于c-typelectin基因表達的報道多集中于其在生物體感染致病微生物的過程中發揮重要的免疫功能[35-36]。Feng等[37]發現，羅氏沼蝦在受到副溶血弧菌和白斑綜合征病毒(WSSV)刺激后，鰓和腸中的MrLec基因表達量均上調。Wang等[38]發現，仿刺參在受到燦爛弧菌刺激后，體腔細胞中的CTL-2 mRNA表達水平顯著上升。

本研究中，c-typelectin基因表達量與對照組相比呈顯著下調或無明顯差異。肝、鰓和肌肉組織中c-typelectin基因表達水平在PFOS脅迫后都出現了顯著降低的情況，腸組織中c-typelectin基因表達水平在PFOS脅迫后沒有顯著性變化，與致病微生物刺激后c-typelectin的基因表達趨勢不同。趙芳芳等[39]單獨用鎘脅迫河南華溪蟹不同時間，肝胰腺、血淋巴中的ShLec21和ShLec23表達量沒有顯著性變化；而鎘脅迫河南華溪蟹后再經細菌感染后，肝胰腺和血淋巴中ShLec21和ShLec23表達量在有些時間段上調。本研究中，除了腸組織，肝、鰓和肌肉組織中的c-typelectin基因在PFOS暴露后均有表達下調而后又上升的情況，可能是由于c-typelectin基因并不參與PFOS的免疫識別，暴露初期，魚體免疫系統為應激防御有毒物質，從而降低了不相關基因的表達，而PFOS暴露損傷了魚體的免疫系統，進而導致水體中致病菌的入侵，c-typelectin基因此時才啟動表達。綜上可知，不同的外源刺激對生物體內c-typelectin基因表達的影響也不相同，C型凝集素作為一種模式識別受體，其特有的結構域能夠識別、結合微生物并在其免疫防御過程中發揮重要作用，而對非生物因子刺激，C型凝集素扮演什么樣的角色還有待進一步研究。

細胞色素c氧化酶(cox)是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復合物，是線粒體呼吸鏈的主要限制酶，cox基因表達量的變化可以反映整條呼吸鏈的效率[40]。而機體在受到外來物質刺激時，其蛋白質利用及糖類的代謝都會大大增加，這些代謝的加快都需要依賴能量的供應，因此，線粒體呼吸鏈的能量供應與機體的免疫機能息息相關。黨紅蕾等[17]對半滑舌鰨肝臟細胞系進行PFOS染毒，發現低濃度PFOS(20 μmol·L-1)進入細胞后，通過與線粒體呼吸鏈輔酶結合，產生活性氧(ROS)并阻礙三磷酸腺苷(ATP)合成過程，產生一系列反應從而誘導細胞啟動DNA修復。本研究中，魚體暴露于PFOS后，鰓組織和肌肉中cox基因相對表達量分別在24 h和48 h上調至峰值，隨后回落。Achard-Joris等[41]認為cox基因上調是為了更有效地消耗分子氧并彌補線粒體活力的下降，通過減少細胞中的活性氧來降低PFOS對機體細胞的損害。而肝和腸組織中cox基因相對表達量顯著下調，推測PFOS所造成的損傷超出細胞自身修復能力導致了cox基因表達的下降。以上結果表明，PFOS能夠對cox基因表達產生影響，進而影響魚體線粒體能量供應以及細胞的正常運轉。

PFOS可影響多種免疫相關基因的表達，本實驗僅選取了其中4個基因對PFOS的免疫毒性進行了初步探討，PFOS的對機體的免疫毒性機制還遠不能被準確闡述，還有待于大量實驗數據的積累，并需要結合功能蛋白的表達等多方面的研究結果進行綜合分析。目前，PFOS的生產和使用已受到嚴格控制，其在自然水域中的濃度遠低于本文中的實驗濃度，但是PFOS在生態系統中的富集效應會對食物鏈高端生物構成潛在威脅，因此，對PFOS毒性仍需作進一步研究。