磁鐵礦納米顆粒與Pb2+復合物對大鼠腎細胞的毒性研究

陳力可，郭昌勝，劉淼，李專，徐建,*

1. 中國環境科學研究院，環境健康風險評估與研究中心，北京 100012 2. 吉林大學新能源與環境學院，長春 130012 3. 吉林省環境監測中心站，長春 130011

隨著現代社會工業的快速發展，水體污染日益嚴重，已經成為威脅和制約人類健康和發展的重要因素。鉛(Pb)是一種重金屬元素，也是水環境中持久性污染物，會對水生態環境和人類健康產生廣泛和嚴重的危害[1]。有研究指出，在環境濃度水平的Pb2+(0.02 μg·mL-1)溶液中暴露96 h即可導致斑馬魚的胚胎毒性及行為異常[2]。Pb2+暴露也會嚴重影響生物體的神經系統、免疫系統、腎臟以及造血系統等，而腎臟是Pb2+在生物體中的主要排泄器官，也是Pb2+的主要靶器官[1,3]。Pb2+對細胞的毒性作用機制目前還不完全清楚，相關研究表明，目前主要的作用機制包括導致細胞活性降低、導致細胞線粒體損傷和誘導細胞凋亡等方式[4]。

近年來，磁鐵礦納米顆粒(magnetite nanoparticles, MNPs)作為一種新型材料越來越受到研究者的廣泛關注，MNPs比表面積大、反應活性高，且具有簡單易回收等特點，目前被廣泛用于水中重金屬元素Pb處理[5]。一項研究表明，海泡石和Fe3O4納米復合材料對水中Pb2+的吸附容量達到96.15 mg·g-1，效果遠高出同類吸附劑，而且成本低廉[6]。因此，這種高效、經濟的方法在污水治理行業中已被迅速地產業化。

雖然MNPs應用范圍十分廣泛，但是關于MNPs處理金屬后形成的復合物對生物和環境的毒性研究卻很有限。而MNPs在生產、使用以及廢棄的過程中將不可避免地進入水生環境[5]，MNPs相對于大顆粒物具有更大的比表面積，一旦進入環境中，可顯著影響環境中污染物的環境行為，或導致污染物生物有效性和毒性效應的改變，從而引發多種生物學效應。污染物之間的相互作用可分為加和作用、協同作用和拮抗作用[7]。例如，全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅單獨與復合暴露均可造成斑馬魚胚胎的氧化損傷和細胞凋亡，但復合暴露組的氧化損傷和細胞凋亡程度明顯大于單獨暴露組，表現出協同作用[8]。姜文博等[9]研究發現，單獨的納米二氧化鈦可劑量依賴性地引起心肌細胞DNA損傷，而叔丁基對苯二酚(tertbutylhydroquinone, tBHQ)與納米二氧化鈦聯合暴露可降低納米二氧化鈦導致的心肌細胞DNA損傷，表現出拮抗作用。協同或拮抗作用會直接或間接地增強或抑制污染物的毒性，因此，研究納米顆粒與污染物復合物的生物毒性效應，對于評價其生物安全性及環境風險具有十分重要的意義。目前，MNPs和Pb2+的毒性研究多限于單一MNPs或Pb2+在實驗室條件下的毒性效應分析，雖然研究發現MNPs對生物體是相對無毒或低毒性的[5,10]，但是MNPs-Pb復合物對細胞和機體的毒性卻鮮有報道，其復合毒性亟待深入研究。

本研究在對MNPs、MNPs-Pb以及培養基等性質進行表征的基礎上，選取大鼠腎細胞作為毒性評價的細胞模型，研究不同Pb含量的MNPs-Pb，以及作為對比的相應濃度的MNPs和Pb2+，對細胞活性、細胞形態和密度、細胞對納米顆粒的攝取以及細胞凋亡的影響，并對MNPs-Pb潛在的毒性效應進行評估。研究結果可為MNPs與重金屬復合物對環境的影響及生物安全性評估提供一定的實驗依據和參考價值。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器和實驗材料

MNPs為吉林大學新能源與環境學院提供，合成方法為共沉淀法[5]，納米顆粒為規則的球狀結構，單分散性較好，粒徑為20～25 nm，經過X射線衍射儀分析，其衍射峰與Fe3O4標準卡JCPDS 79-0491匹配良好，表明成分為Fe3O4。實驗中MNPs所用分散劑為純水。Pb2+標準溶液(1 000 mg·L-1)購自國家標準物質中心。

腎臟是Pb2+毒性作用的主要靶器官之一[3]。大鼠腎細胞是研究Pb2+毒性的常用的體外實驗模型細胞[1,3]，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

主要材料如下：胎牛血清(BR級，購于Gibco公司)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (BR級，購于Gibco公司)，Trypsin-EDTA細胞消化液(BR級，購于Gibco公司)，DMEM培養基(BR級，購于Gibco公司)，ApopNexin Annexin V FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BC級，購于Merck Millipore公司)，WST-1細胞活性檢測試劑盒(BC，購于上海碧云天生物技術有限公司)，戊二醛(BC級購于BASF公司)，檸檬酸鉛(GR級，購于中國國藥集團)和四氧化鋨(GR級，購于中國國藥集團)。

主要儀器及設備如下：微孔板分光光度計(Epoch，Bio Tek，美國)，多維全景流式細胞儀(Merck FlowSight IS100，Millipore，德國)，透射電子顯微鏡(TEM)(H-8100，Hitachi，日本)，倒置相差顯微鏡(Axio Vert.A1，Zeiss，加拿大)，CO2恒溫培養箱(MIR-254-PC，Sanyo，日本)，低溫高速離心機(3K15，Sigma，德國)，電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-AES)(Optima 8000，PE，美國)，掃描電子顯微鏡(SEM)(JSM-6700F，JEOL，日本)，恒溫培養搖床(THZ-300，上海一恒科技，中國)，動態光散射粒度儀(Zetasizer Nano ZS，Malvern，英國)。

大鼠細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3天傳代一次。取對數生長期細胞，用Trypsin-EDTA細胞消化液消化。取適量復合物MNPs-Pb或MNPs或Pb2+加入DMEM中，分別得到濃度為150 μg·mL-1MNPs-1 μg·mL-1Pb(記作MNPs-1 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-3 μg·mL-1Pb (記作MNPs-3 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-5 μg·mL-1Pb(記作MNPs-5 μg·mL-1Pb)；以及150 μg·mL-1MNPs、1 μg·mL-1Pb2+、3 μg·mL-1Pb2+和5 μg·mL-1Pb2+的培養基。分別將細胞暴露于以上濃度MNPs-Pb、Pb2+和MNPs培養基中12 h。

1.2 MNPs與Pb2+復合物的制備及表征

按照相關文獻，在適當pH值的水溶液中進行MNPs對Pb2+的吸附實驗，用Langmuir模型計算MNPs對Pb2+吸附容量[6,11]。在確定MNPs對Pb2+吸附容量后，稱取多份1.2 g MNPs粉末，分別加入pH值為6的200 mL的40、120和200 μg·mL-1的Pb2+溶液中，37 ℃下震蕩24 h后，磁分離，用去離子水將分離后復合物清洗2遍后，冷凍干燥。制得MNPs與Pb2+的復合物MNPs-Pb：MNPs(150 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(50 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(30 mg)-Pb(1 mg)(上述MNPs-Pb的含量，只表示復合物中MNPs和Pb的質量比例，并不代表絕對質量)。最后將適量MNPs和MNPs-Pb超聲分散于DMEM培養基中，用動態光散射粒度儀(DLS)測定納米顆粒的水合粒徑。

1.3 TEM表征

取經過不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的細胞及對照組細胞，按如下方法操作：(1)用PBS清洗細胞2遍；(2)傾去PBS，加入4 ℃的2.5%戊二醛溶液，固定15 min；(3)用細胞刮鏟輕輕將細胞從6孔板中刮下，收集細胞于1.5 mL離心管內，以3 000 r·min-1速度離心15 min，傾去上清液，并用PBS洗滌細胞沉淀1次。然后將細胞沉淀再次離心，對細胞沉淀進行固定、脫水、包埋和切片，用透射電鏡觀察細胞對納米顆粒的攝取[12]。

1.4 細胞活性檢測

取對數生長期貼壁培養大鼠腎細胞，分別添加不同濃度梯度的MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養基，并設置對照組，放入37 ℃培養箱培養12 h。用WST-1法對細胞活性進行檢測，使用微孔板分光光度計在波長450 nm處測定各樣品及對照組的吸光度A450，計算細胞活性[13]。

1.5 細胞形態的光學顯微鏡觀察

取對數生長期的大鼠腎細胞，分別經過消化、離心后接種于6孔培養板，置于培養箱孵育12 h。取出6孔培養板，傾去原有培養基，分別加入2 mL含有不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養基，置于恒溫培養箱中培養12 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和密度的改變[14]。

1.6 細胞凋亡的檢測

取6孔培養板中培養的經過不同濃度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的細胞及對照組細胞。將細胞用AnnexinV FITC/PI染色法染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：在收集各樣品細胞數一致的條件下(每個樣品約8 500個細胞)，分別在525 nm和405 nm的激發波長處采集AnnexinV FITC和PI的熒光強度，將樣品細胞分為早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、正?；罴毎蛪乃兰毎?類[15]。統計各類型細胞百分比，定量分析細胞凋亡水平。

通過明場(bright field)和熒光染色通道觀察細胞形態和染色的變化，對MNPs-Pb和Pb2+組細胞凋亡程度進行定性比較分析。

1.7 數據處理

納米顆粒綜合性質表征、細胞活性、細胞凋亡水平分析均來自3個平行樣品，每個平行樣品均重復測定4次，計算標準偏差，并采用SPSS 18.0軟件對不同處理結果進行方差分析，設定P<0.05為具有顯著性差異，P>0.05為不具有顯著性差異。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 納米顆粒及培養基的綜合性質表征

納米顆粒及培養液的綜合性質表征如表1所示。

為了避免添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb引起的培養基pH值變化影響到細胞的正常生長以及MNPs對Pb2+的吸附，用pH計對添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb的DMEM培養基的pH值進行檢測，結果如表1所示。由表1可知，添加MNPs和MNPs-Pb的培養基pH值接近中性，與空白DMEM比較，pH值沒有顯著改變；雖然加入不同濃度Pb2+的DMEM的pH值略有下降，這是因為Pb2+標準溶液為酸性，而pH值仍然接近中性。因此可知，通過培養液中緩沖液的調節，添加MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM的pH值略微改變，不會對細胞生理功能有顯著影響。相關研究表明，pH值的上升有利于MNPs對Pb2+吸附容量的增加，因為較高的pH值有利于吸附劑表面的去質子化，導致負電荷點的增加，增強了吸附劑表面與Pb2+之間的引力，從而提高了吸附容量[11]。在pH值較低的區域，正電荷中心占主導地位，這增強了吸附劑表面與Pb2+之間存在的斥力，從而降低了MNPs對Pb2+的吸附容量。Nassar等[11]研究發現，在pH值≥6.5范圍內，不利于Pb2+從MNPs-Pb上脫落。因此，本研究的pH條件不會對MNPs-Pb中Pb含量產生顯著影響。

動態光散射是一種常見的膠體和懸浮體表征方法，多用于測定納米粒子的水合粒徑，水合粒徑更能表征納米顆粒在溶液中形成的團聚體實際大小[16]。因為納米顆粒與細胞間的相互作用與其團聚程度密切相關，團聚體的大小是決定納米顆粒能否進入細胞的關鍵因素[17-18]。由表1可知，MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb各顆粒之間的水合粒徑并無顯著差異，平均水合粒徑為441 nm。

2.2 對細胞活性影響的分析

選擇大鼠腎細胞作為受試細胞，用不同濃度的Pb2+、MNPs-Pb和MNPs作用12 h后，用WST-1法測定細胞活性，測試結果如圖1所示。在相同作用時間內，MNPs-Pb組細胞的活性明顯高于Pb2+組細胞的活性。具體而言，MNPs-Pb組細胞的活性在80%～90%之間，不呈現顯著的劑量相關性。而Pb組細胞的活性，均顯著低于對照組。只有1 μg·mL-1Pb2+處理組的細胞活性為83.2%±7.1%，與MNPs-1 μg·mL-1Pb組的細胞活性沒有顯著性差異，其余Pb2+各組均顯著低于相應的MNPs-Pb組，且呈現劑量相關性。MNPs和MNPs-Pb組的細胞活性雖然有輕微的降低，但是各組之間沒有顯著性差異，也未發現與MNPs-Pb中Pb濃度有劑量相關性。細胞活性檢測結果說明，MNPs-Pb復合物較穩定，沒有大量有毒Pb2+溶出，同時可以推測，MNPs和MNPs-Pb對細胞毒性很小。

2.3 細胞形態變化分析

分別用濃度為1、3和5 μg·mL-1的Pb2+和MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb作用大鼠腎細胞12 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及細胞密度變化，結果如圖2所示。

表1 加入MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培養基的綜合性質表征Table 1 Comprehensive property of culture medium (DMEM) with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：MNPs表示磁鐵礦納米顆粒，所有MNPs處理濃度均為150 μg·mL-1。

Note: MNPs stand for magnetite nanoparticles, and the MNPs concentration in all its treatments is 150 μg·mL-1.

圖1 對照組、Pb2+、MNPs和MNPs-Pb各處理組的細胞活性注：a為對照組，b為1 μg·mL-1 Pb2+組，c為3 μg·mL-1 Pb2+組，d為5 μg·mL-1 Pb2+組，e為MNPs組，f為MNPs-1 μg·mL-1 Pb組，g為MNPs-3 μg·mL-1 Pb組，h為MNPs-5 μg·mL-1 Pb組；*和#分別表示各處理組與對照組、MNPs-Pb組與相應濃度Pb2+組比較具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Viability of control cells and cells treated with Pb2+, MNPs and MNPs-PbNote: a. Control group, b. 1 μg·mL-1 Pb2+ group, c. 3 μg·mL-1 Pb2+ group, d. 5 μg·mL-1 Pb2+ group, e. MNPs group, f. MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, g. MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, h. MNPs-5 μg·mL-1 Pb group; significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by # when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+ groups without MNPs.

由圖2可知，對照組細胞(圖2(b))生長狀態良好，呈規則的多邊形，貼壁生長；細胞形態飽滿，胞質清亮，細胞邊界清晰；細胞排列整齊，大小均一，且細胞間隙較小，細胞密度較大。

1 μg·mL-1Pb2+組細胞(圖2(d))與對照組比較，形態改變不明顯，隨著Pb2+作用劑量的增加，Pb2+組細胞(圖2(d)、圖2(f)和圖2(h))形態改變逐漸明顯；可見貼壁細胞數目不斷減少、變小和變圓，而懸浮細胞數目不斷增加，且細胞排列雜亂、形狀不規則、折光性差，細胞連接被破壞、間隙增大。

MNPs組(圖2(a))和MNPs-Pb組細胞(圖2(c)、圖2(e)和圖2(g))，細胞形態飽滿、胞質清亮、細胞間隙較小，與對照組比較，沒有明顯變化。MNPs-Pb組細胞與相應濃度Pb2+組細胞比較，發現只有1 μg·mL-1Pb2+組細胞(圖2(d))和MNPs-1 μg·mL-1Pb組細胞(圖2(c))形態沒有明顯差異，其余各組形態均差異明顯。以上結果表明，在本實驗濃度和時間范圍內，Pb2+對細胞毒性作用更強，未發現MNPs和MNPs-Pb具有強烈毒性而導致大鼠腎細胞形態和密度的顯著改變。

2.4 細胞對納米顆粒的攝取分析

細胞對納米顆粒的攝取，受到納米顆粒濃度和粒徑大小、細胞的種類和數量等因素的影響，而納米顆粒的大小被普遍認為是決定細胞攝取納米顆粒的主要因素[17-18]。本研究中，細胞種類相同、數量一致且納米顆粒濃度相等，只需比較納米顆粒水合粒徑大小。由于MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb之間的水合粒徑沒有顯著差異，細胞對3種納米顆粒的攝取難易程度一致。選取MNPs-5 μg·mL-1Pb和MNPs作用12 h后的細胞，通過TEM觀察，研究細胞對MNPs-Pb和MNPs的攝取，結果如圖3所示。

觀察中只發現少量細胞攝取了MNPs和MNPs-Pb，圖3(a)和圖3(b)中可分別觀察到在細胞質和內吞囊泡中的MNPs和MNPs-Pb。

2.5 對細胞凋亡的影響分析

為了確定細胞凋亡水平，實驗對細胞采用AnnexinV-FITC/PI熒光染色法，并用流式細胞儀來檢測細胞凋亡情況。在總細胞數一致的條件下，對各組細胞的凋亡早期、凋亡晚期細胞百分比含量進行了統計和分析，研究MNPs、Pb2+和MNPs-Pb對大鼠腎細胞凋亡水平的影響。細胞早、晚期凋亡水平如表2和表3所示。

圖3 細胞的TEM圖注：(a) MNPs組，(b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb組。Fig. 3 TEM images of cellsNote: (a) MNPs group, (b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

表2 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+對細胞早期凋亡水平的影響Table 2 Early apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*為與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；#為MNPs-Pb組與相應濃度Pb2+組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

表3 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+對細胞晚期凋亡水平的影響Table 3 Late apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*為與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；#為MNPs-Pb組與相應濃度Pb2+組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

由表2和表3可知，經過不同濃度Pb2+作用12 h后的大鼠腎細胞，與對照組比較，細胞凋亡水平均有顯著升高。具體而言，1 μg·mL-1Pb2+僅導致細胞早期凋亡水平的升高，隨著劑量的增加，細胞早、晚期凋亡水平均顯著增加，顯示出劑量相關性，說明Pb2+濃度的增加促進了大鼠腎細胞的凋亡。MNPs組細胞，早、晚期凋亡水平與對照組比較略有增加，未發現凋亡水平有顯著性差異。而MNPs-Pb組與對照組比較，早、晚期凋亡水平有一定程度的增加，只有早期凋亡水平有顯著性差異，與相應濃度Pb2+組比較，凋亡水平明顯降低。

MNPs-Pb組(圖4(d)、圖4(e)和圖4(f))與相應濃度Pb2+組(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))的凋亡細胞熒光染色形態結果如圖4所示。通過明場通道觀察，Pb2+組與MNPs-Pb組比較，凋亡早期細胞質膜皺縮變小更嚴重，形態改變更明顯，凋亡細胞形態變化更顯著。而通過熒光通道觀察，分別比較Pb2+組與MNPs-Pb組的凋亡早期和凋亡晚期的細胞，Annexin V-FITC的染色增強、熒光明亮，形成了致密濃縮的熒光特征，PI染色也呈現同樣熒光特征，提示質膜的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)外翻以及對細胞核破壞更嚴重，發生了更顯著的細胞凋亡。因此，通過對熒光染色的凋亡細胞的形態觀察，也證實了MNPs對Pb2+的吸附能夠顯著降低Pb2+導致的細胞凋亡水平，與表2和表3結果一致。

圖4 細胞經過Pb2+與MNPs-Pb作用12 h后凋亡早、晚期細胞熒光染色形態圖注：(a) 1 μg·mL-1 Pb2+組，(b) 3 μg·mL-1 Pb2+組，(c) 5 μg·mL-1 Pb2+組，(d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb組，(e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb組，(f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb組。Fig. 4 Fluorescent staining and morphology of early and late apoptosis cells treated with Pb2+ and MNPs-Pb after 12 hNote: (a) 1 μg·mL-1 Pb2+ group, (b) 3 μg·mL-1 Pb2+ group, (c) 5 μg·mL-1 Pb2+ group, (d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, (e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, (f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

3 討論(Discussion)

體外毒性實驗是納米毒理學的重要評估方法。本研究使用大鼠腎細胞作為研究對象，評估MNPs-Pb復合物對細胞的毒性效應。細胞活性實驗及細胞形態觀察結果說明，高劑量Pb2+作用能導致大鼠腎細胞活性的顯著性降低及形態結構的顯著改變；MNPs-Pb復合物顯著降低了Pb2+對細胞活性的抑制和對細胞形態結構的顯著改變，復合物和MNPs對細胞活性只有輕微抑制，對細胞形態和結構沒有顯著改變。有研究發現，MNPs在<200 μg·mL-1條件下對細胞沒有顯著毒性效應，在濃度高達400 μg·mL-1時對細胞也只有程度較低的活性抑制和形態改變，未表現出顯著毒性[10,19]。Hildebrand等[20]研究動物細胞暴露于MNPs與Pd的復合物時發現，細胞活性短期內略微降低，作者認為這可能是細胞短期內應激反應的結果，不會對細胞產生顯著毒性作用。因此，本實驗的結果證明了MNPs-Pb對細胞無顯著的毒性作用。

納米顆粒在細胞內的攝取與細胞毒性直接相關，其毒性作用通常與3個方面有關：(1)納米顆粒進入重要細胞器，如線粒體、細胞核等，影響細胞正常生理功能[19]；(2)產生“木馬效應”，即納米顆粒攜帶有毒“金屬離子”釋放到細胞內，引發細胞毒性的增加[21]；(3)納米顆粒在細胞內溶解，釋放出大量有毒金屬離子[22]。納米顆粒通過內吞作用被細胞攝取主要分為3種類型：吞飲作用、吞噬作用和受體介導的內吞作用，最常見的是非特異性的吞飲作用，以質膜包被顆粒物，內陷形成囊泡及初級溶酶體[17]。由于MNPs-Pb表面無生物配體，因此非特異性的吞飲作用可能是其進入細胞的方式。非特異性的內吞作用與納米顆粒尺寸密切相關，相同納米濃度下，較小的顆粒更易于被細胞攝取[17-18]。納米顆粒被細胞有效攝取的尺寸閾值為200 nm[17]，由于MNPs-Pb和MNPs水合粒徑均大于此閾值，且MNPs-Pb的水合粒徑更大，因此在相同納米顆粒濃度下，細胞對MNPs-Pb和MNPs的攝取量很低，且MNPs-Pb攝取量低于對MNPs的攝取量。研究發現，多種磁性氧化鐵納米材料被細胞攝取后，通常會聚集于內體、溶酶體或細胞質內，在重要細胞器中未發現納米顆粒[19,22]，與本研究中TEM觀察結果一致。

對裸核MNPs和表面修飾的MNPs的一項研究表明，進入細胞溶酶體內的納米顆粒96 h后仍保持原有化學形態，對細胞沒有顯著毒性影響[22]，因此，12 h的暴露時間內，MNPs和MNPs-Pb在細胞內性質穩定，可能不會有大量Fe2+/Fe3+溶解。而另一項關于MNPs對Pb2+的吸附實驗結果表明，形成的MNPs-Pb在1 mmol·L-1的硝酸作用下，僅有少量Pb2+溶解到溶液中，而未加入硝酸的溶液中，幾乎沒有Pb2+從MNPs-Pb上脫落[11]。由于<2.07 μg·mL-1的Pb2+對細胞影響較小[23]，在接近中性的生理環境中，12 h的暴露時間，微量的MNPs-Pb被細胞攝取，可能不會有大量能導致細胞毒性的Pb2+脫落。Auffan等[21]研究與MNPs性質類似的納米γ-Fe2O3與As的復合物對動物細胞作用時也發現了類似現象，即細胞對復合納米顆粒的微量攝取，在細胞內未發生“木馬效應”導致顯著的細胞毒性。綜上所述，被攝取的微量MNPs-Pb可能不會對細胞產生顯著毒性效應。

盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是半胱天冬酶(caspase)在凋亡過程中起著必不可少的作用。細胞凋亡主要包含2種重要機制，對于外源性凋亡，外來信號與死亡受體發生作用活化半胱天冬酶，進一步引發凋亡；對于內源性凋亡，線粒體受損可能會激活細胞色素C的釋放，并進一步激活半胱天冬酶的級聯反應[24-25]。在Pb2+誘導的細胞凋亡機制中，線粒體途徑被認為是介導凋亡的主要方式，Pb2+可以誘導胞內產生大量自由基，破壞線粒體功能，影響線粒體的融合與分離，導致線粒體損傷并最終引發凋亡[26]。本研究中，流式細胞儀對凋亡水平的分析和凋亡形態學觀察結果表明，Pb2+可以導致細胞凋亡率上升，而MNPs對Pb2+的吸附，能夠顯著降低Pb2+通過線粒體途徑導致的細胞凋亡，從而減少Pb2+對細胞的損傷和毒性作用。由于Pb2+導致的細胞凋亡是Pb2+引起腎臟毒性的重要機制之一[27]，而少量的細胞凋亡不破壞整個組織結構，不引發炎癥反應，能很好地維持器官的功能穩定[28-29]，因此，可以通過MNPs對Pb2+的吸附降低Pb2+導致的腎臟損傷。李專等[19]研究MNPs與Cr6+的復合物的細胞毒性時也發現了類似現象，即MNPs對Cr6+的吸附，降低了Cr6+導致的細胞凋亡，復合物本身未導致大量細胞凋亡，減弱了對細胞的毒性作用。

綜上所述，在本實驗濃度和暴露時間條件下，Pb2+能夠顯著抑制大鼠腎細胞活性，改變細胞形態，促進細胞凋亡，對細胞有顯著的毒性作用，并且呈現劑量相關性；在本實驗濃度和暴露時間下，利用MNPs吸附水環境中Pb2+形成的復合物MNPs-Pb對大鼠腎細胞沒有顯著的毒性作用，MNPs對Pb2+的吸附可能是Pb2+的細胞毒性降低的原因。

急性毒性效應反映細胞短期內的損傷情況，但不能確定細胞長期的病理變化。本研究選擇了單一濃度的MNPs與不同濃度的Pb2+在短時間內進行單獨和聯合暴露實驗，而復合毒性與污染物的濃度范圍、混合配比以及暴露時間密切相關，因此，不同濃度、配比的MNPs和Pb2+對細胞的長期復合作用及作用機理需要進一步的研究和確認。