苯并[a]芘和1-羥基芘誘導人胚胎干細胞分化心肌細胞ROS、CYP基因表達和DNA損傷

吳彬彬，晏斌，胡梅，陳曦,5，梁巖

1. 中國科學院深圳先進技術研究院，深圳 518055 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 香港大學李嘉誠醫學院，香港 4. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101 5. 電子科技大學資源與環境學院，成都 611731

多環芳烴(PAHs)是有機物未充分燃燒產生的化合物，其主要來源有化石燃料、森林火災和火山爆發等。PAHs是重要的環境和食品污染物，暴露于PAHs能增加基因突變以及患癌癥和心血管疾病的風險[1-2]。在已知的150余種PAHs中，苯并[a]芘作為高環PAH，長期以來被認為可誘導活性氧(ROS)、突變并具有致癌作用。此外，越來越多的證據表明，苯并[a]芘暴露與心臟疾病密切相關[1,3-4]，可導致心臟肥大、心臟發育缺陷和致命性缺血性心臟病等。苯并[a]芘可以吸附在大氣細微顆粒表面，也可以在抽煙或食物燒烤過程中產生，苯并[a]芘被人體攝入或吸入后，可與芳烴受體(AhR)結合，導致AhR轉移至細胞核，誘發下游基因(例如CYP1A1)的轉錄和表達，促使與突變密切相關的二氫二醇環氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene-7,8dihydrodiol-9,10-epoxide, BPDE)-DNA加合物的形成，而一旦心臟的關鍵DNA序列發生突變，就會產生災難性的后果[5-6]。

為了評估PAHs的暴露水平，尿液1-羥基芘已被廣泛用作PAHs暴露的標志物[7-9]。1-羥基芘是由CYP1A1催化的芘的代謝物，在尿液中排出。據報道，PAHs職業暴露后，1-羥基芘濃度與心臟自主神經功能障礙有關[2]。然而，目前關于闡釋苯并[a]芘和1-羥基芘對心臟疾病影響的研究鮮有報道。到目前為止，苯并[a]芘和1-羥基芘誘發人類心臟病的機制尚不清楚，而部分原因是由于缺少基于人源心肌細胞的研究模型。近年來，作為一種新興的心肌細胞模型，人胚胎干細胞分化心肌細胞(hESC-CM)引起了廣泛的關注，它為藥物檢測、心臟發育、功能和病理生理學研究提供了一個相對便宜和方便的研究載體[10]。hESC-CM能夠通過干細胞培養和分化持續獲得，且與其他動物細胞相比，對人類而言沒有物屬差異。因此，hESC-CM越來越多地被用于心臟疾病的研究中。

基于以上信息，本研究將通過分析苯并[a]芘和1-羥基芘暴露后hESC-CM的ROS、CYP基因表達和DNA損傷，探討苯并[a]芘和1-羥基芘對心臟可能的毒性機制。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

H7細胞購于WiCell研究所(WiCell Research Institute, Inc.，美國)，E8培養基、RPMI 1640培養基、DMEM/F12培養基、B27+supplement、Geltrex和PrestoBlue試劑購于美國Life Technology公司，MatriGel購于美國B&D公司，Y27632(純度≥99%)購于美國R&D公司，CHIR 99021(純度99.2%)購于美國Selleck Chemicals公司。OxiSelectTMcomet asssay試劑盒購于美國Cell Biolabs公司，CYP1A1抗體購于英國Abcam公司，BPDE-DNA抗體(5D11)購于美國Santa Cruz Biotechnology公司，IWR-1(純度≥98%)、苯并[a]芘(純度≥96%)和1-羥基芘(純度98%)購于美國Sigma公司，6孔和96孔板購于美國康寧公司。PrimeScrip RT試劑盒購于日本TAKARA公司，活性氧檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和心肌細胞分化

使用E8培養基培養人胚胎干細胞系(H7細胞)。將未分化的H7細胞以每孔1×105個細胞接種在Matrigel包被的6孔板上直至80%～90%匯合，然后在第0天加入6 μmol·L-1CHIR 99021。從第2天開始，更換為RPMI/B27培養基，然后在第3天加入10 μmol·L-1IWR-1并在第5天更換RPMI/B27培養基一次。將hESC-CM維持在RPMI/B27+培養基中培養。細胞培養28 d后，進行后續實驗。

1.2.2 細胞活力測定

使用二甲基亞砜(DMSO)溶解苯并[a]芘和1-羥基芘，并倍數稀釋成200～6.25 μmol·L-1系列濃度。將稀釋后的苯并[a]芘和1-羥基芘溶液加入到Geltrex預包被的含有hESC-CM的96孔培養板上，0.1% DMSO作為對照組。24 h后，將PrestoBlue試劑加入各孔，37 ℃和5% CO2條件下孵育30 min，使用ELx800Biotek酶標儀及Gene5軟件(Biotek, USA)檢測細胞熒光值。

1.2.3 ROS檢測

接種在Geltrex預包被培養板上的hESC-CM經系列濃度的苯并[a]芘或1-羥基芘處理24 h后，培養基更換為含有10 μmol·L-1DCFH-DA(上海碧云天生物技術有限公司)的RPMI/B27+培養基，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，1×D-PBS(杜氏磷酸鹽緩沖液，不含Ca2+和Mg2+)洗滌2次，使用熒光顯微鏡(Eclipse 800, Nikon，日本)拍照，使用Image J軟件進行數據分析。

1.2.4 RNA提取和qPCR分析

使用50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羥基芘處理48 h后，使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取hESC-CM總RNA，使用PrimeScrip RT試劑盒合成cDNA。目的基因在StepOnePlusTM(Applied Biosystem，美國)平臺上用SYBR?PremixEx TaqTM進行擴增，qPCR條件為95 ℃、3 min預變性，35個循環，具體為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s。采用GAPDH作為內參。PCR引物序列如表1所示。

1.2.5 免疫熒光實驗

使用50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羥基芘處理48 h后，使用預冷的D-PBS洗滌2次，然后用4%多聚甲醛固定15 min，D-PBS洗滌3次，室溫下用含10%胎牛血清的封閉緩沖液孵育1 h。CYP1A1抗體或BPDE-DNA抗體4 ℃孵育過夜，然后D-PBS洗3次后，二抗室溫下孵育1 h。最后再用D-PBS洗3次，用熒光顯微鏡(Eclipse 800, Nikon，日本)拍照，Image J軟件進行數據分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6 彗星試驗

為了檢測50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羥基芘誘導的DNA損傷，使用OxiSelectTMcomet asssay試劑盒進行堿性彗星試驗。細胞處理48 h后，D-PBS洗滌，塑料刮收集細胞，然后將細胞轉移到1.5 mL EP管中，700 g離心2 min，預冷的D-PBS洗2次。然后調整細胞數量為1×105個·L-1。將細胞與瓊脂(V/V=1∶10)混合，以75 μL每孔涂到載玻片上，4 ℃下放置15 min，然后將載玻片轉移到預冷的裂解緩沖液中裂解1 h，再置于預冷堿性溶液30 min。最后，使用堿性電泳液電泳30 min，并進行DNA染色。使用熒光顯微鏡(Eclipse 800, Nikon，日本)對細胞進行拍照，使用Image J進行數據分析。

1.2.7 統計分析

采用Image J 1.52a軟件進行熒光強度分析，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，數據以平均值±SD表示，P<0.05為具有統計學差異。

2 結果(Results)

2.1 細胞活力檢測

作為國際癌癥研究機構確定的一種致癌PAHs，已有多項研究報道苯并[a]芘能降低細胞活力(表2)。根據細胞培養條件、處理時間和細胞種類的差異，苯并[a]芘抑制細胞活力的濃度范圍為1～50 μmol·L-1(表2)。然而，Sirenko等[11]通過鈣黃綠素-乙酰甲酯(Calcein-AM)信號檢測發現，低濃度的苯并[a]芘(1 μmol·L-1)能增加hiPSC-CM細胞活力，而高濃度(10 μmol·L-1)時則降低細胞活力；An等[12]研究發現，苯并[a]芘對LO2細胞活力沒有影響。因此，苯并[a]芘對不同細胞毒性可能存在不同。作為具有非增殖特征的新型細胞模型，苯并[a]芘處理hESC-CM后，并未改變其細胞活力。此外，1-羥基芘對hESC-CM的活力也沒有顯著影響。

2.2 苯并[a]芘和1-羥基芘誘導ROS的產生

通過DCFH-DA檢測了苯并[a]芘和1-羥基芘處理后hESC-CM內的ROS水平。處理48 h后，50 μmol·L-1的高濃度1-羥基芘能夠顯著誘導hESC-CM內ROS的產生，但低濃度1-羥基芘(5和25 μmol·L-1)對ROS的產生無顯著影響(圖1(a))。但對于苯并[a]芘，hESC-CM內的ROS水平呈現明顯的劑量-反應關系(圖1(b))，這與已有報道結果相一致[15,18]。10 μmol·L-1的苯并[a]芘能顯著增加hESC-CM內的ROS水平，表明對于hESC-CM，苯并[a]芘誘導ROS的能力強于1-羥基芘。

圖1 在hESC-CM中1-羥基芘(a)和苯并[a]芘(b)誘導活性氧(ROS)的生成水平注：DMSO表示二甲基亞砜，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 1 The reacitve oxygen species (ROS) production induced by 1-hydroxypyrene (a) and benzo[a]pyrene (b) in hESC-CMNote: DMSO stands for dimethyl sulfoxide, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

表2 苯并[a]芘對細胞活性的影響Table 2 The cell activity under benzo[a]pyrene treatment

注：Calcein-AM表示鈣黃綠素-乙酰甲酯，MTT表示3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，XTT表示2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-氫氧化四唑，PrestoBlue表示基于刃天青的即用型溶液；#，與對照組相比，細胞活力有統計學差異(P<0.05)；*，50%抑制效應濃度(IC50)；&，單位為μg·mL-1。

Note: Calcein-AM stands for Calcein acetoxymethyl ester; MTT stands for 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide; XTT stands for 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide; PrestoBlue is a ready to use cell permeable resazurin-based solution; #, compared with the control group, there were statistically significant differences in cell activity; *, 50% inhibitory concentration (IC50); &, the unit is μg·mL-1.

2.3 線粒體凋亡基因的表達

Bcl-2、bad和bax是細胞內重要的凋亡相關基因，在線粒體凋亡中發揮重要作用。苯并[a]芘作用hESC-CM后，誘導了bad的表達(P=0.05)(圖2(a))，表明苯并[a]芘能夠誘導hESC-CM凋亡，這與已有研究報道相符[19]。1-羥基芘處理hESC-CM后，Bcl-2和bad的表達都略有增加，但均無統計學差異(圖2(b))。1-羥基芘是芘的代謝物，而已有研究表明，芘是一種能刺激ROS產生的PAH[20-21]。1-羥基芘處理對hESC-CM線粒體凋亡基因的表達無顯著影響，提示催化芘轉化為1-羥基芘的關鍵酶——細胞色素P450(CYP450)酶可能發揮了重要作用[22-23]，其可能催化芘轉化為1-羥基芘，降低了細胞的ROS水平，而ROS是線粒體凋亡基因表達的重要誘因之一。

圖2 苯并[a]芘(a)和1-羥基芘(b)誘導hESC-CM線粒體凋亡相關基因表達Fig. 2 hESC-CM apoptosis-related gene expression induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b)

2.4 CYP基因及蛋白表達水平

苯并[a]芘處理細胞48 h后，CYP1A1的表達量與對照相比顯著增加(圖3(a))。此外，盡管沒有統計學差異，但1-羥基芘暴露也增加了hESC-CM的CYP1A1表達量(P>0.05，圖3(b))。進一步通過免疫熒光實驗檢測了CYP1A1蛋白的表達水平，結果表明，苯并[a]芘和1-羥基芘處理均能增加CYP1A1蛋白的表達(圖3(c)和(d))，與基因表達的結果相一致。

2.5 DNA加合物檢測

為了進一步分析苯并[a]芘和1-羥基芘對hESC-CM的毒性作用，通過免疫熒光檢測了細胞DNA加合物水平。結果表明，苯并[a]芘可以顯著誘導hESC-CM DNA加合物的產生(圖4(a))。而作為PAHs在體內代謝的產物和人體PAHs暴露的檢測標志物，1-羥基芘暴露也能導致hESC-CM DNA加合物的增加(圖4(b))，提示1-羥基芘也存在誘導心肌細胞損傷的風險。

2.6 DNA損傷檢測

分析了苯并[a]芘和1-羥基芘作用于hESC-CM后細胞DNA的損傷情況，結果如圖5所示。與對照組相比，50 μmol·L-1苯并[a]芘增加了hESC-CM的DNA損傷水平(P=0.05)。此外，雖然1-羥基芘沒有顯著誘導DNA損傷，但它具有增加hESC-CM DNA損傷的趨勢(P=0.06)。

3 討論(Discussion)

在心臟內，ROS參與多種細胞信號傳導途徑，并在許多生物學過程中發揮重要作用。苯并[a]芘誘導細胞ROS的產生已被廣泛報道[12,14]，但苯并[a]芘和1-羥基芘是否誘導hESC-CM產生ROS尚不清楚。目前，僅有少量研究報道，1-羥基芘與急性心肌梗死氧化應激有關[24]。心肌細胞長期暴露于ROS會導致心律失常，缺血再灌注損傷，并通過誘導心臟肥大、壞死和纖維化導致心臟重塑[25-26]。此外，作為一種主要在線粒體中產生的自由基[25]，ROS能夠通過促進線粒體凋亡基因和p53蛋白的表達來誘導心肌細胞的凋亡[26-27]，因此，苯并[a]芘誘導hESC-CM線粒體凋亡基因bad的表達與ROS密切相關。

人體暴露于PAHs后，PAHs會被人體內的代謝酶所代謝。其中，CYP家族的主要功能是對內源性和外源性化合物進行轉化[23]。目前，在哺乳動物CYP家族中已發現了幾種參與PAHs代謝的基因。在這些基因中，CYP1A1在苯并[a]芘的代謝中發揮重要作用。CYP1A1在細胞和組織中普遍表達[28]，當細胞暴露于PAHs后會誘導CYP1A1的表達(圖3)。通常，CYP1A1催化苯并[a]芘轉化為苯并[a]芘-7,8-環氧化物，其能迅速代謝為苯并[a]芘-7,8-二氫二醇，然后被CYP1A1進一步活化產生苯并[a]芘-7,8-二氫二醇-9,10-環氧化物(BPDE)，PAHs的毒性主要反映在體內氧化酶的代謝產物中。由PAHs產生的代謝物可以進一步與DNA反應，形成BPDE-DNA加合物(圖4)，導致基因DNA序列中G到T的堿基突變[29]，促進細胞突變和DNA損傷(圖5)。心肌細胞DNA損傷的積累能誘導DNA損傷反應的持續激活[30]，導致炎性細胞因子的表達增加，進而引發壓力超負荷引起的心力衰竭的發生發展[31]。此外，DNA損傷還與細胞衰老密切相關，心肌細胞衰老能促進心血管疾病的發生[32]，在衰老和心力衰竭中已觀察到異常的心肌變化[32-33]。

圖3 苯并[a]芘和1-羥基芘誘導hESC-CM CYP1A1基因和蛋白的表達注：(a)和(b)為苯并[a]芘和1-羥基芘處理后基因的表達，(c)和(d)為苯并[a]芘和1-羥基芘處理后蛋白的表達；*表示P<0.05。Fig. 3 The gene and protein expression of CYP1A1 in hESC-CM induced by benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyreneNote: (a) and (b), gene expression after benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyrene treatment; (c) and (d), protein expression after benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyrene treatment; *represents P<0.05.

圖4 苯并[a]芘(a)和1-羥基芘(b)誘導DNA加合物的產生注：*表示P<0.05。Fig. 4 DNA adducts induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b) Note: *represents P<0.05.

圖5 苯并[a]芘(a)和1-羥基芘(b)誘導hESC-CM DNA損傷Fig. 5 DNA damage of hESC-CM induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b) respectively

總之，PAHs與心臟疾病密切相關，本研究基于hESC-CM模型研究了PAHs典型代表性物質苯并[a]芘和人體暴露后檢測標志物1-羥基芘的心肌細胞毒性。結果表明，苯并[a]芘和1-羥基芘能導致hESC-CM細胞的氧化應激和DNA損傷。據筆者所知，目前尚未有基于hESC-CM的苯并[a]芘和1-羥基芘導致心肌細胞損傷的報道。因此，本研究在體外實驗中首次直接證明了苯并[a]芘和1-羥基芘可以誘導人干細胞源心臟細胞損傷，這為PAHs暴露與心臟功能障礙關系的進一步研究夯實了理論基礎。

致謝：感謝香港大學Kenneth R. Boheler教授、Ellen Ngar-yun Poon助理教授及博士研究生Stanley Chun-ming Wu在實驗中給予的幫助。