雙酚A替代品與雙酚A對非洲爪蛙急性毒性及其應激響應的比較

牛玥，朱敏，劉芃巖，秦占芬,*

1. 中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085 2. 河北大學化學與環境科學學院，保定 071002 3. 中國科學院大學，北京 100049

雙酚A(bisphenol A, BPA)是全球大量生產的化學品之一，主要用于生產聚碳酸酯塑料和環氧樹脂[1]。動物和人類通過多種途徑暴露于這種化學物質[2]。動物試驗研究表明，BPA在生物體生殖、發育和神經功能等方面具有毒性效應[3-5]，近幾年的流行病學調查數據也表明，BPA與人類某些疾病相關[6]，所以，一些國家和政府開始限制BPA的使用范圍。相應地，BPA類似物開始作為BPA的替代品被投入生產和使用，如雙酚F(bisphenol F, BPF)、雙酚S(bisphenol S, BPS)、雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)等。BPA替代品在多種環境介質、生物樣品乃至人體樣品中都有檢出[7-9]，因此，BPA替代品的安全性受到越來越廣泛的關注。

BPA替代品與BPA的化學結構相似[10]，可能存在與BPA類似的效應，已有文獻報道BPF、BPS有與BPA類似的激素活性[11]，可產生內分泌干擾效應[12]。資料顯示，BPA對大鼠、小鼠和兔的經口暴露半致死劑量(LD50)分別為240、3 250和2 230 mg·kg-1[13-14]；BPF對大鼠的經口暴露LD50為4 950 mg·kg-1[13-14]。李圓圓等[15]發現，BPA和BPF對黑斑蛙蝌蚪的半致死濃度(LC50)分別為9.00和9.52 mg·L-1；任文娟等[16]報道了BPA、BPF和BPAF對斑馬魚的LC50分別為8.09、9.51和2.47 mg·L-1。當生物體暴露于化學品時，生物體為保護自身免受損傷而做出一系列的應激響應[17]，如氧化應激與熱休克反應。在生物體內谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase, GST)和硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)等是氧化應激的良好指標[18]。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是生物體在不良環境因素作用下所產生的一組特殊的蛋白質，能維持細胞穩態應對環境變化，從而起到分子伴侶的作用。HSPs基因一般主要分為hsp90、hsp70、hsp60和小hsp共4個家族。氧化應激與熱休克反應是應激響應的主要組分，是生態毒理學中用來評價化學品毒性的常用指標[18]。許多體外和動物試驗表明，BPA可以誘導生物體釋放活性氧產生氧化應激[18-19]。Jain等[20]研究發現，BPA暴露導致大鼠體內活性氧水平升高，產生氧化應激。還有研究表明，BPA不但能夠改變秀麗隱桿線蟲幼蟲中GST活性，還能夠改變蝸牛體內hsp70和hsp90的表達[17,21]。流行病學研究表明，人體尿液中BPA的濃度與氧化應激水平相關[22-24]。

本文選用兩棲動物非洲爪蛙作為實驗材料，通過研究LC50、氧化應激和熱休克蛋白相關基因轉錄水平，比較BPA及替代品對非洲爪蛙的急性毒性以及其引起的蛙體的應激響應，從而進一步分析BPA及替代品的生態風險，同時為BPA及替代品的毒性研究提供有效數據。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗動物

本實驗室飼養的非洲爪蛙的成年雌蛙和雄蛙，分養于盛有去氯自來水的玻璃缸中，水溫(22±2) ℃，明暗光周期為12 h∶12 h。成蛙喂食1∶1配比的豬肝和商品飼料，喂食2 h后換水，每周2次。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黃體素釋放激素(LHRH)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU的上述激素。將雌雄蛙放于產卵容器中，置于黑暗、安靜的環境中讓其抱對，12 h左右即可產卵。受精卵在(22±1) ℃的去氯自來水中孵化，胚胎發育至48期的蝌蚪，進行暴露試驗。

1.2 試劑與儀器

儀器和設備：高速冰凍離心機(5810/5810R，Eppendorf，德國)；PCR儀( MiniAmp，Applied Biosystem，美國)；熒光定量PCR儀(MX3500P，Strata gene，美國)；組織碾磨儀(MM301，Retsch，德國)；渦旋混勻器(VORTEX 2，WIGGENS，美國)；全自動核酸提取儀(AU1001，北京百泰克生物技術有限公司)；電子天平(JA2003B，上海越平科技儀器有限公司)；移液器(Eppendorf，德國)；全自動凝膠成像儀(GBOX-HR，Syn Gene，英國)；普通PCR儀(My Cycler TM，BIO-RAD，美國)；電泳儀(DYCP-31F，北京六一儀器廠)。

試劑：BPA(CAS No. 80-05-7，純度97%，ACROS Organics，分子量228.29)；BPF(CAS No. 620-92-8，純度>99%，東京化成工業，分子量200.24)；BPAF(CAS No. 1478-61-1，純度99%，北京百靈威科技有限公司，分子量336.23)；二甲基亞砜(DMSO，CAS No. 67-68-5，純度≥99.5%，Sigma-Aldrich，美國)；核酸染料(G-red)和RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR試劑盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，北京)；PCR引物(華大基因，北京)。

1.3 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗

BPA、BPF和BPAF用助溶劑DMSO配成100 g·L-1的儲備液。設置溶劑對照組，其中溶劑的濃度與最高濃度處理組溶劑濃度相同，溶劑的體積濃度不超過0.01%。暴露實驗在玻璃缸內進行，每個缸盛有1 L暴露液，蝌蚪隨機放入10尾。每隔24 h換一次水，清除死亡個體，記錄死亡數，實驗持續48 h。

在正式實驗之前先對3種化學物質進行較大濃度范圍(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預試驗，不設平行組，各濃度的缸中加入10尾蝌蚪，觀察記錄48 h蝌蚪死亡數。根據預試驗得出的結果，設置正式試驗濃度。正式試驗以1.2為公比設置5個濃度梯度(表1)和溶劑對照組，每組3個平行，每個缸中隨機加入10尾蝌蚪。其他同預實驗，重復2次正式試驗。

表1 雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)和雙酚AF(BPAF)的濃度設置Table 1 Concentration of bisphenol A (BPA), bisphenol F (BPF) and bisphenol AF (BPAF)

1.4 RNA提取和RT-qPCR

每個缸隨機取2尾蝌蚪，全自動核酸提取儀提取RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳來確定RNA完整性。然后根據Fast Quant RT Kit(with g DNase)說明書配制20 μL反應體系進行反轉錄。

根據SYBR Green PCR Kit說明，配制10 μL反應體系進行RT-qPCR。PCR程序為：95 ℃預變性15 min，40個循環擴增(95 ℃變性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每個基因在使用之前都進行了擴增效率的驗證，計算公式為E=(10-1/slope-1)×100。擴增效率在90%～110%之間、溶解曲線單一且重合、不存在非特異性擴增的基因時，可用于后續實驗。進行基因表達分析時，以rpl8為管家基因對各個基因的表達進行標準化[25]?；虻南鄬Ρ磉_量根據公式2-ΔΔCT計算[26]。引物及相關信息如表2所示。

1.5 數據統計

用SPSS 16.0進行數據分析。統計單元為缸，即n值等于平行缸數[27]。重復2次正式試驗，得到相似的結果，在文中只呈現其中一次的試驗數據[28]?；貧w分析使用Probit，建立“劑量-效應”線性方程，并計算LC50值及其95%置信區間。統計數據均以平均值±標準誤(standard error of mean, SEM)表示。暴露組與各自的對照相比，顯著性差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05認為有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗

溶劑對照組中非洲爪蛙蝌蚪無死亡，試驗質量控制良好。BPA、BPF和BPAF暴露組蝌蚪均有不同程度的死亡(圖1)。24 h時，4.82 mg·L-1BPA、7.23 mg·L-1BPF和1.93 mg·L-1BPAF暴露組的蝌蚪存活率分別為93.33%、83.33%和100%，10.00 mg·L-1BPA暴露組蝌蚪的存活率為20%，15.00 mg·L-1BPF和4.00 mg·L-1BPAF暴露組蝌蚪的存活率相同，均為0%。48 h時，5.79 mg·L-1的BPA暴露組中蝌蚪的存活率由24 h的76.67%下降到73.33%，12.50 mg·L-1的BPF暴露組的蝌蚪存活率與24 h時相比下降了16.67%，其他濃度暴露組的蝌蚪存活率不變。觀察蝌蚪死亡現象時發現，15.00 mg·L-1BPF暴露組實驗開始不久，蝌蚪沉到水底，很快死亡，其他濃度BPF暴露組的部分蝌蚪也出現了上述現象，并清楚看到存活蝌蚪的腮充血，在顯微鏡下觀察發現，存活蝌蚪心臟的血液回流緩慢甚至堵塞。暴露于4.00 mg·L-1BPAF的蝌蚪，先是快速沒有規律地游動，同時皮膚迅速發白，很快死亡，這種現象隨暴露組濃度的降低而消失。10.00 mg·L-1BPA暴露組的蝌蚪，行動遲緩，最終死亡，其他濃度BPA暴露組的部分蝌蚪也出現該現象，暴露組濃度越低該現象越不明顯。

經統計分析得到BPA、BPF和BPAF對蝌蚪的24 h-LC50分別為7.59、11.58和2.87 mg·L-1；48 h-LC50分別為7.54、11.01和2.87 mg·L-1(表3)。毒性強弱順序為BPAF>BPA>BPF。

圖1 BPA、BPF和BPAF暴露后非洲爪蛙蝌蚪的存活率Fig. 1 Survival rates of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA, BPF and BPAF

表2 RT-qPCR引物及相關信息Table 2 Primers sequences and relevant information for RT-qPCR

表3 BPA、BPF和BPAF對非洲爪蛙蝌蚪的LC50及其95%置信區間和回歸方程Table 3 LC50, 95% confidence interval and regression equations of BPA, BPF and BPAF to Xenopus laevis tadpoles

注：LC50及其95%置信區間的單位為mg·L-1。

Note: The unit of LC50and its 95% confidence interval is mg·L-1.

2.2 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內氧化應激相關基因轉錄水平的影響

RT-qPCR結果表明(圖2)，暴露48 h后，4.82～10.00 mg·L-1的BPA和7.23～12.50 mg·L-1的BPF顯著上調蝌蚪體內gr、gst和trx這3種基因的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內gst的相對表達量遠高于8.33 mg·L-1BPA暴露組。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內gr和trx的表達量與8.33 mg·L-1BPA暴露組類似。4.82～10.00 mg·L-1的BPA顯著下調蝌蚪體內gpx的轉錄水平，7.23～8.68 mg·L-1的BPF與4.82～10.00 mg·L-1的BPA類似，但12.50 mg·L-1的BPF顯著上調gpx的轉錄水平，呈現高濃度促進低濃度抑制的趨勢。BPAF暴露組蝌蚪體內gst和gr基因的相對表達量與BPAF暴露濃度呈“倒U型”關系，濃度分別為2.78和2.31 mg·L-1時，gst和gr的相對表達量最高。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調蝌蚪體內trx和gpx的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系。

2.3 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白轉錄水平的影響

RT-qPCR結果表明(圖3)，暴露48 h后，4.82～8.33 mg·L-1的BPA顯著下調蝌蚪體內hsp27和hsp90的轉錄水平，4.82～10.00 mg·L-1的BPA對蝌蚪體內hsp70的轉錄水平沒有顯著影響。與BPA不同，7.23～12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內hsp27、hsp70和hsp90的表達均沒有顯著影響，但15.00 mg·L-1的BPF顯著抑制hsp27和hsp90的表達水平。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調蝌蚪體內hsp70和hsp90的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系，但對蝌蚪體內hsp27基因沒有顯著影響。

3 討論(Discussion)

檢測結果表明，BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50排序為：BPF(11.01 mg·L-1)>BPA(7.54 mg·L-1)>BPAF(2.87 mg·L-1)。根據危險化學品分類準則[29]，BPA和BPAF對非洲爪蛙的毒性為中等毒性，BPF對非洲爪蛙的毒性略低于中等毒性標準。最近的研究表明，BPA及替代品對黑斑蛙和斑馬魚的毒性均為中等毒性[15-16]。

圖2 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的氧化應激相關基因轉錄水平的影響注：*表示P<0.05。Fig. 2 Oxidative stress related gene transcription level of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

圖3 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的熱休克蛋白轉錄水平的影響注：*表示P<0.05。Fig. 3 Transcriptional levels of heat-shock protein of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

BPA和BPF對非洲爪蛙蝌蚪體內氧化應激相關基因gr、gst和trx轉錄水平的影響呈線性劑量-效應關系。對比BPF與BPA相似濃度暴露組(如8.68 mg·L-1BPF暴露組與8.33 mg·L-1BPA暴露組)蝌蚪體內gst、gr和trx的相對表達量后，發現BPF暴露組蝌蚪體內的gst基因的相對表達量高于BPA暴露組，BPF暴露組蝌蚪體內gr和trx的相對表達量與BPA暴露組類似。整體來看，BPF對蝌蚪體內氧化應激水平的影響與BPA相近。分析BPAF和BPA暴露組數據發現，2.31 mg·L-1的BPAF暴露組中蝌蚪體內gst、gr和trx基因的相對表達量與10.00 mg·L-1的BPA暴露組類似，此結果說明2.31 mg·L-1的BPAF與10.00 mg·L-1的BPA產生類似的氧化應激效應，所以BPAF對蝌蚪體內氧化應激水平的影響強于BPA。另發現，BPA及替代品對蝌蚪體內gpx基因表達水平的影響有所不同。BPA暴露組蝌蚪體內gpx表達被顯著下調；12.50 mg·L-1的BPF顯著上調蝌蚪體內gpx的表達水平，7.23～8.68 mg·L-1則顯著下調gpx的表達水平；BPAF顯著上調蝌蚪體內gpx基因的表達水平，呈線性劑量-效應關系。有研究表明，暴露于不同重金屬污染物的生物體內gpx的表達水平表現為雙向效應(降低或增加)，主要取決于污染物種類[20-35]。這可能為BPA及替代品對蝌蚪體內gpx轉錄水平的不同影響提供合理的解釋。綜合考慮以上結果，BPF對非洲爪蛙體內氧化應激水平的影響與BPA相近，BPAF強于BPA。

BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白表達的影響結果表明，BPA暴露組(10.00 mg·L-1除外)蝌蚪體內hsp27和hsp90的表達被顯著下調。Morales等[21]研究發現，蝸牛暴露于100和500 μg·L-1BPA 48 h后，體內hsp70和hsp90基因的轉錄水平下降。還有研究表明，秀麗隱桿線蟲暴露于250和500 μmol·L-1BPA 24 h后，體內的hsp70基因表達下調[17]。以上研究的實驗物種和BPA暴露濃度與本實驗不同，但BPA對生物體內熱休克蛋白的影響與本研究BPA的實驗結果類似。此外，BPF、BPAF對蝌蚪體內熱休克蛋白的影響與BPA不一致：7.23～12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內熱休克蛋白的表達水平沒有顯著影響，15.00 mg·L-1的BPF顯著下調hsp27和hsp90的表達；BPAF對蝌蚪體內hsp27的表達沒有顯著影響，但BPAF顯著上調蝌蚪體內hsp70和hsp90的表達，呈線性劑量-效應關系?？傮w來看，BPA和BPAF均影響蝌蚪體內熱休克蛋白的表達水平，而BPF對蝌蚪體內熱休克蛋白表達沒有顯著影響。

綜上所述，BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的毒性強弱順序為：BPAF>BPA>BPF；BPAF對非洲爪蛙體內氧化應激水平的影響最大，BPF與BPA相近；BPA和BPAF顯著影響非洲爪蛙體內熱休克蛋白表達水平，BPF沒有影響顯著影響。本文可為BPA及替代品的生產和使用以及相應的環境管理提供毒理學參考數據。