姥鮫烷誘導法建立小鼠狼瘡腎炎模型*

沈立軍，顏天銘，王玉玉，孔 永

（蘇州大學 1生物醫學研究院，2醫學部免疫學系，江蘇蘇州215123；3江蘇荃信生物醫藥有限公司，江蘇泰州225300）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是由環境、遺傳和內分泌等多種因素導致機體免疫耐受喪失、免疫功能紊亂進而造成包括腎臟在內的多組織器官慢性損傷的自身免疫性疾病[1]。研究表明環境因素在致機體氧化應激、細胞凋亡過度及促進自身抗原產生并引發自身免疫應答中發揮重要作用[2-3]。來源于礦物油中的烯烴化合物姥鮫烷（pristane）為細胞膜激活劑，可導致細胞毒性、誘導凋亡及產生活性氧中間體，促進產生自身抗原及形成炎性內環境，激活自身免疫細胞，從而打破自身免疫耐受，導致SLE的發生[4-5]。

SLE動物模型主要有自發性和誘導性之分，其中自發性模型有NZB×NZ、MPL/lpr、BXSB等；誘導性模型有化學物質誘導模型及慢性移植物抗宿主病模型，化學物質誘導模型的誘導劑有伴刀豆球蛋白A、細菌脂多糖、姥鮫烷等。1994年，McGaha等[6]應用姥鮫烷誘導BALB/c小鼠出現類似于人類SLE的癥狀，首次建立了姥鮫烷誘導的狼瘡小鼠模型。與自發性狼瘡小鼠模型所不同的是該模型側重于研究環境因素打破機體免疫耐受以及導致SLE的機制，為探究非遺傳因素在SLE發病過程中的作用提供了有力的工具，現在也成為最常用的SLE小鼠模型之一[7]。Calvani等[8]的研究表明，姥鮫烷在體內外均可誘導細胞凋亡，為打破免疫耐受提供了自身核抗原，引發自身抗體形成，進而形成免疫復合物沉積于各臟器，造成病理損害。鑒此，本文采用姥鮫烷單次腹腔注射誘導建立C57BL/6小鼠狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）模型，通過對免疫細胞活化、自身抗體產生、細胞因子表達及腎臟病理改變等指標的綜合分析，并首次使用透射電鏡觀察該模型腎臟組織超微結構的改變，研究誘導模型形成及病理損傷的表現及演變過程并探討其免疫機制。

材料和方法

1 材料

6～8周齡雌性清潔級C57BL/6小鼠購自蘇州大學實驗動物中心。胎牛血清購自HyClone；DMEM基礎培養基購自Gibco；姥鮫烷購自Sigma；抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA）及抗雙鏈DNA（doublestanded DNA，dsDNA）抗體檢測試劑盒購自北京和杰創新生物醫學科技公司；Albustix試紙購自Bayer；PE標記的抗CD11b、CD11c、Gr1及CD21抗體，FITC標記的抗B7-1及B7-2抗體，APC標記的抗MHC-Ⅱ抗體均購自eBioscience；PE標記的抗小鼠IgG抗體購自杭州聯科生物技術公司；兔抗鼠干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）及白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體、DAB及DAPI染液購自武漢博士德公司。

CO2細胞培養箱購自Thermo；高速離心機和流式細胞儀購自Beckman Coulter；倒置顯微鏡購自Olympus；超低溫冰箱購自Thermo；超凈工作臺購自Airtech。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立 全部小鼠在整個實驗過程中置于蘇州大學實驗動物中心屏障系統SPF級飼養。小鼠隨機分組，每組15只：模型（model）小鼠組予一次性腹腔注射0.5 mL姥鮫烷；陰性對照（control）組小鼠以同一方式注射等量生理鹽水。

2.2 脾臟免疫細胞活化分析 注射后第10天每組處死5只小鼠，制備脾臟細胞懸液，經破除紅細胞、洗滌后分別采用直接免疫熒光法標記及流式細胞術分析脾臟細胞的CD11b、CD11c、Gr1和CD21表達及CD21+B細胞表面B7-1、B7-2和MHC-Ⅱ的表達。

2.3 ANA和抗dsDNA抗體的檢測 每月眼眶靜脈叢取血及分離血清，參照試劑盒說明采用間接免疫熒光法測定ANA和抗dsDNA抗體表達及滴度。血清稀釋后，與HEp2細胞玻片或dsDNA抗原玻片反應區室溫孵育30 min，并設陽性及陰性對照，經洗滌、與FITC標記的羊抗鼠IgG避光孵育30 min后洗去未結合抗體，封片置于正置熒光顯微鏡（Leica）下觀察。

2.4 尿蛋白檢測 每月取小鼠晨尿，采用Albustix試紙測定蛋白尿程度。根據試紙反應區顯色程度判定尿蛋白含量（g/L）：（-）：0；（±）：0.15～0.30；（+）：0.30～1.00；（++）：1.00～3.00；（+++）：3.00～20.00；（++++）：＞20.00。

2.5 腎臟免疫復合物沉積檢測 注射后8個月處死小鼠，分離腎臟以4%中性甲醛固定，5 μm石蠟切片，常規脫蠟及水化，進行微波加熱抗原修復，5%BSA封閉，PE標記的抗小鼠IgG抗體室溫孵育2 h，PBS洗去未結合抗體，DAPI液染色10 min，PBS沖洗，封片后于熒光顯微鏡下觀察。

2.6 腎臟組織IFN-γ和IL-4免疫組化分析 同2.5操作進行腎臟組織固定、切片、脫蠟及抗原修復，封閉后分別用兔抗鼠IFN-γ及IL-4抗體室溫孵育2 h，洗片后予0.3%H2O2孵育15 min，加入HRP標記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，洗滌后加入DAB孵育10 min，蒸餾水終止反應，玻片經烘干、二甲苯透明及封片后于光鏡下觀察。

2.7 腎臟病理學檢查 同2.5操作進行腎臟組織固定、切片及脫蠟后，常規HE染色，制片完畢后于光鏡下觀察。

2.8 腎臟組織超微結構透射電鏡分析 取注射8個月后處死的小鼠腎臟，切成1 mm×1 mm×1 mm小組織塊，4%戊二醛前固定24 h及1%鋨酸后固定1 h，30%及50%丙酮各脫水15 min，70%丙酮飽和醋酸鈾處理過夜，80%及90%丙酮各脫水15 min，無水丙酮脫水10 min，3次。100%丙酮與包埋劑等量混合液浸透1 h及包埋劑浸透2 h，進行包埋后于35℃、45℃及55℃下依次聚合12 h，聚合完成后進行超薄切片及染色，于透射電鏡下觀察。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；有序分類等級資料采用Ridit分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠的生存狀態及一般病變

從第14周起，模型組小鼠出現脫毛、毛色暗淡、行動遲緩等表現；隨著時間推移，3只小鼠出現不同程度腹水，1只小鼠極度消瘦并于第7個月時死亡。8個月時小鼠腹腔內可見各臟器根部、腸系膜上附有大小數量不一的白色顆粒狀或團塊狀脂肪肉芽腫，見圖1A，經檢查證實為肌肉、脂肪及炎性細胞包裹姥鮫烷增生形成的異位淋巴組織，見圖1B、C。模型組小鼠可見脾臟腫大并呈暗紅色，見圖1D；正常對照組小鼠的脾臟呈鮮紅色，形態正常，見圖1E。

Figure 1.Pathological change of pristane-induced mouse lupus nephritis model.A：lipogranulomas in abdominal cavity of model mice；B，C：HE staining of lipogranulomas；D：the appearance of spleen in model group；E：the appearance of spleen in control group.圖1 姥鮫烷誘導的小鼠狼瘡腎炎模型的一般病變

2 脾臟免疫細胞的活化狀況

小鼠給予姥鮫烷后第10天，脾臟中巨噬細胞（CD11b+）、DC（CD11c+）、粒細胞（Gr1+）及 B 細胞（CD21+）均出現不同程度活化，與對照組相比差異有統計學顯著性（P＜0.05），見圖2A。CD21+B細胞表面的B7-1、B7-2及MHC-Ⅱ表達率也呈現顯著上調（P＜0.05），見圖2B。

Figure 2.In vitro assay of the activation degrees of mouse splenic immune cells.A：the expression rates of CD11b，CD11c，Gr1 and CD21 on the mouse splenic immune cells；B：the expression rates of B7-1，B7-2 and MHC-II on the splenic CD21+B cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group.圖2 脾臟免疫細胞的活化

3 血清ANA和抗dsDNA抗體的檢測

3個月時模型組小鼠的ANA和抗dsDNA抗體陽性率為30%和10%，滴度分別為1∶100～1∶300與1∶10～1∶30，4～7個月間二者陽性率及滴度不斷上升，至第8個月時ANA與抗dsDNA抗體表達的陽性率分別達到100%（+++：6只；++：2只；+：1只）和89%（+++：5只；++：3只；-：1只），見圖3A，同時ANA檢測亦顯示出不同的染色形態，見圖3B，而對照組未檢測到ANA與抗dsDNA抗體的表達。

Figure 3.Detection of ANA and anti-dsDNA antibodies in serum.A：the ANA and anti-dsDNA antibodies in serum of pristane-induced mouse lupus nephritis model（×400）；B：staining type of ANA by indirect immunofluorescence assay（×400）.圖3 血清ANA和抗dsDNA抗體的檢測

4 尿蛋白的測定

4個月時，模型組30%小鼠出現蛋白尿，尿蛋白含量為0.3～3 g/L，隨著時間推移，蛋白尿陽性率和尿蛋白含量不斷增加，8個月時蛋白尿陽性率達100%，尿蛋白含量為1～20 g/L，與對照組相比差異具有統計學顯著性（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠蛋白尿程度的比較Table 1.Comparison the degree of proteinuria（n=10）

5 腎臟免疫復合物沉積的檢測

8個月時，小鼠腎臟組織經直接免疫熒光法檢測，模型組小鼠可見熒光呈線狀、團塊狀沿腎小球毛細血管壁、系膜區連續性分布，襯托出腎小球輪廓，免疫復合物沉積嚴重，而對照組腎臟中熒光微弱或未見，與模型組呈現出明顯的差異，見圖4。

Figure 4.Immune complex deposition on mouse kidneys observed by fluorescene microscopy（×400）.圖4 腎臟免疫復合物的沉積

6 腎臟組織IFN-γ和IL-4免疫組化分析

8個月時模型組及對照組小鼠腎臟毛細血管壁及腎小管上皮細胞均可檢測到IFN-γ和IL-4的表達。模型組IFN-γ表達強度明顯高于對照組，而IL-4表達強度的差別不明顯，見圖5。

Figure 5.The images of immunohistochemical analysis for determining the expression of IFN-γ和IL-4 in mouse kidneys（×400）.圖5 腎臟IFN-γ和IL-4的免疫組化分析

7 腎臟HE染色及病理檢查

8個月時，模型組小鼠部分腎小球細胞數量明顯增多，系膜基質和系膜細胞增生，腎小球內淋巴細胞侵潤；部分腎小球毛細血管袢萎縮以及變性壞死，腎小囊腔增大；少數腎小球呈現階段性壞死并伴有內皮細胞增生。對照組小鼠腎小球未見明顯的淋巴細胞侵潤及明顯體積增大或壞死現象，毛細血管袢薄及囊腔清晰分明，內皮細胞和系膜細胞正常，見圖6。

Figure 6.HE staining analysis of mouse kidneys（×400）.圖6 腎臟HE染色分析

8 腎臟的超微結構透射電鏡分析

模型組小鼠在第8個月時可見腎小球基底膜增厚、層次模糊、系膜插入、足突融合、足細胞及內皮細胞微絨毛化壞死，系膜基質增生等現象，并可見基膜內、系膜區及內皮下等部位呈不同程度電子致密物沉積；對照組小鼠腎小球僅見足細胞輕微融合和內皮下少量電子致密物沉積，但基底膜厚度均勻，腎臟超微結構基本正常，見圖7。

Figure 7.Ultrastructure analysis of mouse kidneys by transmission electron microscopy.圖7 腎臟超微結構透射電鏡分析

討 論

建立狼瘡動物模型是研究該類疾病病因、發病機制進而尋找相應治療手段的必要途徑，對于SLE的認識和治療具有重要的促進作用。目前常用的SLE動物模型有自發性、誘發性和基因調控型3種。自發性和基因調控型模型側重研究遺傳因素對SLE發病的影響，對于全面理解由多種因素綜合作用而導致的SLE具有其局限性。誘發性模型是采用非自身免疫病易感小鼠運用物質誘導產生狼瘡癥狀，具有發病早、動物源廣泛及經濟實用等特點，尤其在當今環境問題突出，環境因素的致病作用和機理正日益引起重視的背景下，該類模型為研究環境因素如何誘導SLE發病提供了有力的手段。

姥鮫烷也稱降植烷，化學名為 2，6，10，14-四甲基十五烷（2，6，10，14-tetramethylpentadecane，TMPD），是來源于礦物油、植物、海洋生物的類異戊二烯烷烴類化合物[8]。姥鮫烷可促進巨噬細胞分泌IL-6等細胞因子以及導致活性氧簇產生與炎性環境的形成，并可通過線粒體途徑誘導腹腔內細胞凋亡而產生自身抗原[9]，從而誘導機體打破免疫耐受及T、B細胞的異?；罨c應答。本研究中發現姥鮫烷注射后第10天脾臟巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞、抗體產生細胞（B細胞）較對照組均呈現顯著的活化。Bruns等[10]也檢測到姥鮫烷誘導的BALB/c小鼠模型中CD3+CD28+T細胞增加，本研究8個月時模型組小鼠大量異位淋巴組織形成及脾臟腫大的表型也印證了姥鮫烷誘導后小鼠免疫應答的異常增強。

姥鮫烷誘導腹腔內細胞凋亡以致產生大量細胞碎片和自身抗原，在炎性環境和免疫細胞活化的背景下，導致自身抗體產生。本研究采用間接免疫熒光法檢測了狼瘡腎炎指標抗體ANA和抗dsDNA抗體的情況[11]，結果顯示二者于3個月時出現，并且其陽性率和滴度隨著時間的推移均逐漸增加，這些結果說明了該物質可誘導小鼠產生針對核抗原的自身抗體及自身免疫反應的持續增強。

自身抗體識別結合沉積于腎臟組織的循環抗原、腎臟細胞凋亡形成的原位抗原及腎臟組分形成的復合物，以及循環中自身抗原、抗體形成的復合物成為腎臟組織中免疫復合沉積的主要來源[12-14]。本研究對免疫復合物在腎臟沉積狀況進行了檢測，結果顯示8個月時模型組小鼠腎小球毛細血管壁、系膜區出現明顯的連續性分布的熒光，提示本模型免疫復合物腎臟沉積現象嚴重。

腎臟組織中自身抗原及免疫復合物可刺激腎臟組織細胞表達趨化因子及受體，進而促進炎性細胞侵潤、炎性細胞因子分泌、補體激活，從而導致腎臟組織的慢性損傷[15-16]。本研究免疫組化分析顯示，腎臟組織中IFN-γ出現明顯的表達上調，提示LN疾病晚期Th1型細胞因子占優勢作用，此結果與Richards等[17]的報道一致，但此結果可能只展現了疾病特定階段、特定受累組織的狀況，而細胞因子的表達譜實際受到疾病狀態及進展的密切影響[15]。

自身抗原及免疫復合物導致的炎性損傷持續進行最終可導致姥鮫烷誘導的小鼠出現免疫復合物型腎炎[18]，本研究中小鼠腎臟HE染色及透射電鏡病理分析結果均顯示出淋巴細胞侵潤、組織壞死、電子致密物沉積等明顯的腎臟病理損傷，符合符合狼瘡腎炎分類標準中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型改變[19-20]。同時本研究中模型組8個月時出現的較高的尿蛋白含量表明模型鼠腎臟功能嚴重受損。

綜上所述，本研究采用姥鮫烷誘導的方法成功建立C57BL/6小鼠狼瘡腎炎模型，具有LN特異性抗體、蛋白尿及免疫復合物型腎炎等類似人類SLE的癥狀，證明了環境因素影響SLE發病的重要性。同時通過對免疫細胞活化、自身抗體產生及組織病理學改變等指標的分析探討了環境因素誘導模型形成和病理損傷的機制，為研究對該模型的免疫干預效應奠定了實驗基礎。