膽管癌脾酪氨酸激酶表達增高對腫瘤微環境巨噬細胞M2型極化的影響*

袁 輝，林澤龍，胡 敏，蔣煜川，劉 珂，曲 辰，洪 健，，△

（1南方醫科大學中西醫結合醫院腫瘤中心，廣東廣州510315；2暨南大學附屬第一醫院肝膽外科，3暨南大學藥學院藥學系，4暨南大學基礎醫學院病理生理系，廣東廣州510632）

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）惡性程度高，易向周圍組織侵犯及遠處轉移，預后極差[1-2]，患者的5年生存率僅為20～30%。手術切除、化療和輔助放療是膽管癌的主要治療手段，尚缺乏有效的靶向藥物[3]。膽管癌發生發展是一個多因素、多階段和多步驟的慢性演變過程，主要包括膽管增生、膽管異型增生、膽管瘤和膽管癌[4-5]。因此，探索膽管癌發生發展的調控機制與有效靶標，是目前膽管癌研究的重要方向。前期研究中我們觀察到肝臟增生的膽管中脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）表達顯著升高[6]，本研究擬通過構建自發誘導的大鼠和小鼠肝內膽管癌模型，進一步探究膽管癌演變進程和人膽管癌組織中SYK的表達變化及其作用機制。

材料和方法

1 組織標本

本研究涉及的48例人膽管癌標本和癌旁肝組織（距腫瘤邊緣＜2 cm）及15例人正常肝組織標本（患者因血管瘤接受切除手術）均來自暨南大學附屬第一醫院。上述標本均獲明確的病理學診斷，術前未接受過任何抗腫瘤治療。本研究獲得暨南大學附屬第一醫院倫理委員會的批準，符合醫學倫理學規定。

2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠40只[8～9周齡，體重（350±20）g]和SPF級雄性BALB/c小鼠30只（7周齡）均購于南方醫科大學動物實驗中心[許可證號為SCXK（粵）2016-0041]，飼養于獨立通氣籠盒（individually ventilated caging，IVC）系統中，溫度為（23±1）℃，濕度為45%，自由飲食。

3 實驗試劑

硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）和二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）均購自 Sigma-Aldrich；SYK抑制劑entospletinib（GS-9973）購自Selleck；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、檸檬酸鹽緩沖液、山羊血清和抗體稀釋液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗SYK、CK19、CD163和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體均購自Abcam；免疫組化II抗及辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒購自Dako；熒光II抗和細胞核染色試劑（DAPI）購自Thermo Fisher。

4 主要方法

4.1 大鼠肝內膽管癌模型的構建[7]、分組及處理將40只大鼠隨機分為實驗組（35只，每天飲用含300 mg/L TAA的飲用水）和空白對照組（5只，正常飲水），飼養于IVC系統中，每周2次監測體重變化，分別于第9、12和16周末每次處死3只大鼠，第24周末處死16只大鼠，開腹觀察肝臟表面及其病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。24周后，將剩余的10只SD大鼠隨機分為對照組和SYK抑制劑（7.5 mg/kg）組，每組5只，每天定時灌胃給藥，對照組給予等體積的溶劑。每周2次監測體重變化并觀察大鼠狀態，共持續4周。麻醉下開腹觀察肝臟表面及其病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。

4.2 小鼠肝內膽管癌模型的構建[5]雄性BALB/c小鼠30只，飼養于IVC系統中。將小鼠隨機分為空白對照組（6只，不作任何處理）和實驗組（24只）。實驗組小鼠于第1和2周，給予DEN（100 mg/kg）腹腔注射；于第5周末，在1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉下，開腹行左中位膽管結扎；從第6周開始至第28周，每周給予DEN（25 mg/kg）灌胃1次。每周2次監測體重變化，分別于第9、12和16周末每次處死5只小鼠，第28周時處死剩余小鼠，開腹觀察肝臟病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。

4.3 免疫組織化學染色 制備2 μm厚的肝組織連續切片，常規脫蠟水化，滴加3%雙氧水，消除內源性過氧化物酶的活性后微波修復抗原，冷卻至室溫后山羊血清37℃封閉30 min，抗SYK、CK19、iNOS和CD163抗體用抗體稀釋液1∶100稀釋，4℃孵育過夜；PBS漂洗后滴加生物素標記的II抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精染色，常規脫水透明封片。

4.4 免疫熒光染色 切片常規脫蠟水化，微波修復抗原，冷卻至室溫，山羊血清37℃封閉30 min，加入混合抗體[抗SYK抗體（1∶100）+抗iNOS抗體或抗CD163抗體（1∶50）]，4℃孵育20小時；PBS漂洗后滴加熒光標記的II抗，室溫孵育60 min；PBS漂洗后DAPI染色，吹干封片，使用熒光顯微鏡觀察。

5 統計學處理

采用GraphPad Prism 7軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用t檢驗或單因素方差分析，兩變量的相關分析采用Pearson直線相關分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成功構建大鼠和小鼠肝內膽管癌模型

在大鼠膽管癌模型中，肝臟大體形態與顯微鏡下肝組織改變：第9周末肝臟形態正常，鏡下可見部分匯管區小膽管增生，即膽管細胞數目增多，增生后的膽管有明確的邊界和管腔結構，未見細胞異型性；第12周末大鼠肝臟表面有凹凸不平小顆粒，鏡下可見部分膽管異型增生，即增生的膽管具有異常的管腔輪廓，細胞核大、深染、異型性，核膜不規則，明顯的核仁和核極性喪失，未侵犯周圍組織；第24周末大鼠肝臟顏色晦暗，表面凹凸不平，可見多個白色圓形質硬結節（直徑最大約10 mm），通過HE染色法觀察到細胞發生癌變，具有細胞核大、深染、異型性等組織學改變，侵及周邊正常肝組織，CK19染色（肝臟膽管細胞來源的特征性標志物）確診為膽管癌，見圖1（紅色箭頭所指分別為大鼠正常膽管、膽管增生、膽管異型增生和膽管癌中的CK19陽性細胞）。

在小鼠膽管癌模型中，第12周末小鼠肝臟形態大致正常，鏡下可見部分小膽管增生（具體組織學改變同大鼠膽管增生）；第16周末小鼠肝臟表面有質軟囊性腫物，鏡下HE染色可診斷為膽管瘤，肝匯管區可見局灶性紊亂排列的膽管，細胞未見明顯異型性；第28周末肝臟可見不規則白色質硬結節（最長徑約10 mm），HE染色可見異型腫瘤細胞，CK19染色證實為膽管細胞來源，見圖2（紅色箭頭所指分別為小鼠正常膽管、膽管增生、膽管瘤和膽管癌中的CK19陽性細胞）。

2 膽管癌演變進程中SYK表達逐漸升高

肝組織中SYK陽性染色為棕黃色或棕褐色，定位于細胞質和細胞核，正常肝細胞存在SYK陽性表達，而正常膽管細胞未見SYK陽性表達。與大鼠正常肝組織的膽管細胞相比，膽管增生時開始出現SYK異常表達（表達水平相對較低），隨著疾病進展，SYK表達水平逐漸增高，在膽管異型增生和膽管癌組織中SYK均呈陽性表達（P＜0.01），見圖3A（紅色箭頭所指為膽管結構和膽管癌中的SYK陽性細胞）。小鼠模型中SYK表達呈現相似趨勢：肝臟膽管增生組織中開始呈現SYK異常表達，在膽管瘤和膽管癌中SYK表達逐步升高（P＜0.01），見圖3B（紅色箭頭所指為膽管結構和膽管癌中的SYK陽性細胞）。

3 膽管癌組織中M2型巨噬細胞浸潤增加

與大鼠和小鼠正常肝組織相比，相應膽管癌組織中M2型巨噬細胞（CD163陽性）浸潤數目增多，而M1型（iNOS陽性）數目相對減少（P＜0.01），見圖4（紅色箭頭所指為iNOS/CD163陽性細胞）；但在膽管癌發生早期（膽管增生、異型增生和膽管瘤）的病變組織中，未見M1和M2型巨噬細胞的浸潤數目顯著變化。此外，在48例人膽管癌/匹配癌旁肝組織和15例正常肝組織中，免疫組化染色顯示CD163陽性細胞在腫瘤周圍區域的浸潤數量顯著高于腫瘤內區域和正常肝組織（P＜0.01），見圖5A（紅色箭頭所指為CD163陽性細胞）。

4 膽管癌組織中SYK與M2型巨噬細胞的相關性

檢測48例人膽管癌/匹配癌旁肝組織和15例正常肝組織中SYK的表達情況，結果顯示人膽管癌組織中的SYK表達量均顯著高于癌旁和正常肝組織（P＜0.01），見圖5A（紅色箭頭所指為膽管癌中SYK陽性細胞）。對人膽管癌組織的SYK和CD163表達進行Pearson相關分析顯示，SYK的異常表達與浸潤的CD163陽性細胞數呈正相關，即與M2型巨噬細胞浸潤數量呈正相關（r=0.57，P＜0.01），見圖5B。通過SYK與iNOS或CD163免疫熒光共染顯示，正常肝臟膽管組織存在大量的M1型巨噬細胞，少量M2型巨噬細胞，未見SYK表達；膽管癌組織中SYK與CD163高表達，未見iNOS明顯表達，見圖5C。

Figure 3.SYK expression was gradually increased in two murine spontaneous induction models of cholangiocarcinoma（CCA）.Immunohistochemical（IHC）analysis for SYK protein expression in the development of rat（A）and mouse（B）CCA models.The scale bar=100 μm.Red arrows indicate SYK positive cells.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group.圖3 SYK在大鼠和小鼠膽管癌演變進程中的異常表達

5 靶向SYK治療抑制大鼠膽管癌的腫瘤生長和巨噬細胞M2型極化

對照組的大鼠肝臟表面可見多個白色圓形質硬結節（直徑最大約10 mm），SYK抑制劑（GS-9973）組的大鼠肝臟腫瘤直徑較小，數量較少，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖6（黃色圓圈部分為膽管癌）。通過HE染色，進一步證實肝臟表面的白色圓形質硬結節為膽管癌病變；此外，與對照組相比，SYK抑制劑組肝臟組織中M2型巨噬細胞的數量顯著減少（P＜0.01），見圖6。

討 論

膽管癌是一種預后較差的肝臟原發惡性腫瘤。近年來，其發病率和死亡率逐年升高[8]。膽管癌發病隱匿，確診時常為晚期，手術、化療和放療等傳統治療手段療效有限，因此發展膽管癌早期診斷（干預）與新靶向治療手段是膽管癌防治研究的重要方向。本研究通過構建大鼠和小鼠原發肝內膽管癌模型，模擬了包括膽管增生、膽管異型增生和膽管瘤，到最終形成膽管癌的人類膽管癌發生發展演變進程。結果顯示，增生的膽管細胞和膽管癌細胞中高表達的SYK可能通過誘導M2型巨噬細胞極化和浸潤，促進膽管癌發生發展。

Figure 4.The infiltration of M2 macrophages was increased in two murine spontaneous induction models of cholangiocarcinoma（CCA）.Immunohistochemical analysis for M1 macrophages（iNOS）and M2 macrophages（CD163）infiltrating in rat（A）/mouse（B）CCA and normal liver tissues.The scale bar=100 μm.Red arrows indicate iNOS/CD163 positive cells.Mean±SD.n=5 in normal group；n=16 in CCA group.**P＜0.01 vs normal group.圖4 膽管癌自發誘導動物模型中M2型巨噬細胞浸潤增加

Figure 5.Relationship between SYK expression and M2 macrophage infiltration in human cholangiocarcinoma（CCA）tissues.A：immunohistochemical（IHC）staining of SYK and CD163（M2 macrophage marker）in 48 human CCA tissues（peritumor and intratumor），and analysis of SYK IHC scores and CD163+M2 macrophage infiltration（red arrows indicate SYK/CD163 positive cells）；B：the expression of SYK is positively correlated with M2 macrophage infiltration in human CCA tissues；C：double immunofluorescence images for SYK（green）and CD163/iNOS（red）in normal and CCA liver tissues.The scale bar=100 μm.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs peritumor group.圖5 人膽管癌組織中SYK表達與M2型巨噬細胞浸潤的關系

Figure 6.SYK inhibitor GS-9973 inhibited the tumor growth and M2 macrophage polarization in progressive rat model of cholangiocarcinoma（CCA）.Gross images，HE staining and immunohistochemical analysis for M2 macrophages（CD163）were shown.Red arrows indicate CD163 positive cells.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs vehicle group.圖6 SYK抑制劑GS-9973抑制大鼠膽管癌的腫瘤生長和巨噬細胞M2型極化

SYK是一種非受體型酪氨酸激酶，正常生理條件下主要參與淋巴細胞成熟及免疫細胞活化[9]。近年來研究顯示，在免疫性疾病[10]、白血病[11]、乳腺癌[12]、肝癌[13]、卵巢癌[14]等病理過程中，SYK同樣發揮重要功能。我們前期研究結果顯示，肝纖維化組織中，SYK表達增高；SYK可促進肝星狀細胞的激活與增殖；靶向SYK可有效抑制動物肝纖維化進展及其肝癌發生，是治療肝臟纖維化的潛在靶點[6]。目前，已研發出多種SYK小分子化合物抑制劑，并應用于多種疾?。ò愶L濕性關節炎、慢性淋巴細胞白血病等）的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗。

具有免疫抑制作用的M2型巨噬細胞，在多種惡性腫瘤的發生發展過程中發揮重要促進作用[15-16]。SYK參與了血液腫瘤和多種實體腫瘤的免疫應答和反應，對巨噬細胞的增殖分化及其產生的生物學效應具有重要作用[17]。本課題組在前期關于肝纖維化的研究中觀察到：在大鼠膽管結扎模型中，由膽管結扎引起的增生膽管細胞內出現SYK表達顯著升高，并且增生膽管周圍伴有M2型巨噬細胞浸潤增加。為進一步研究增生膽管細胞中SYK高表達與M2型巨噬細胞浸潤的關系，以及對膽管癌發生發展的影響。在本研究中，我們構建了兩種動物膽管癌自發誘導模型，模擬了人膽管癌從膽管增生、膽管異型增生、膽管瘤，到最終形成膽管癌的演變過程。上述兩個動物模型的結果顯示：隨著膽管癌的發生過程，SYK表達水平逐漸增高，提示SYK表達與膽管癌發生發展相關；膽管癌中SYK異常表達伴隨M2型巨噬細胞浸潤數目增多，提示SYK可能參與誘導巨噬細胞M2極化，這一結果在人膽管癌組織標本中得到進一步驗證。此外，TAA誘導的大鼠自發膽管癌模型給予SYK抑制劑處理，結果顯示SYK抑制劑可以顯著減少膽管癌組織中的M2型巨噬細胞浸潤，并抑制膽管癌發生發展。上述結果表明，隨著膽管癌的演變進展，SYK表達逐漸升高，可能是通過影響巨噬細胞M2型極化促進腫瘤進展，SYK抑制劑可以有效抑制腫瘤生長和巨噬細胞M2型極化。

本研究表明，SYK異常表達與膽管癌發生發展密切相關：在膽管癌發生早期，即膽管增生時就已經出現SYK異常表達，并隨著病程進展逐漸升高；而增生膽管細胞和膽管癌細胞中高表達的SYK可以通過誘導微環境M2型巨噬細胞極化與浸潤進，促進膽管癌進展。這些結果雖然揭示了膽管癌中SYK對M2型巨噬細胞浸潤的影響，但其具體調控機制仍不明確。有研究報道，巨噬細胞的極化依賴于PI3K信號通路，PI3K可引起腫瘤中致瘤性巨噬細胞（多數為M2型巨噬細胞）的增多。此外，SYK是激活巨噬細胞中PI3K所必需的，在PI3K的上游發揮重要作用?；蚯贸蛩幚硪种芐YK和PI3K，均可以阻斷腫瘤的生長和巨噬細胞介導的免疫抑制，激活先天性和適應性抗腫瘤免疫力。因此，SYK可能通過PI3K通路影響腫瘤中巨噬細胞極化，是重要的腫瘤免疫學靶標之一[18]。在后續研究中，本課題組將繼續深入探索膽管癌進展中SYK的功能與調控機制，重點關注SYK對膽管癌細胞旁分泌細胞因子的影響與調控作用，以進一步明確膽管癌細胞SYK影響M2型巨噬細胞極化的分子機制。

綜上所述，本研究提示SYK在膽管癌發生發展過程中發揮重要作用，可能成為膽管癌早期干預與靶向治療的潛在靶點。此外，我們還初步探討了膽管癌中SYK異常表達對巨噬細胞M2型極化的影響，為進一步深入開展膽管癌SYK的具體調控機制提供了參考資料。