miR-150-5p在卵巢癌中的表達及其生物學功能研究

蔣小平 樊華 嚴建耀 朱紅玲

卵巢癌作為婦科常見腫瘤之一，其發病率和死亡率均較高，與其他腫瘤發病相似，卵巢癌發生發展與細胞侵襲、血管生成等密切相關[1]。研究報道[2]稱卵巢癌的發生發展與癌基因的異?；罨磉_有關。近期有學者[3]研究發現，微小RNA(miRNA)能夠調控相關癌基因，作為非編碼的小分子RNA，miR-150-5p由22個核苷酸構成，有研究[4]已經證實其能夠通過某種特定通路參與腫瘤的發生發展。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)在多種腫瘤中處于激活狀態，參與腫瘤細胞的增殖和凋亡過程。研究報道[5]，抑制PI3K/Akt能夠明顯降低癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，而miR-150-5p是否能夠基于PI3K/Akt信號通路來對卵巢癌細胞增殖凋亡的機制進行調控尚未有研究報道。因此，本研究通過干擾miR-150-5p的表達，研究其對卵巢癌增殖、凋亡和PI3K/Akt信號通路影響，以期為臨床治療卵巢癌提供新的靶點。

材料和方法

一、臨床標本及資料

選取2016年4月—2018年12月于本院婦科就診的82例卵巢癌患者作為研究對象，患者年齡22～65周歲，平均(43.5±6.8)歲。納入標準：(1)經病理學檢測確診為卵巢癌的患者；(2)納入患者均為初次診斷；(3)在本院經手術切除卵巢癌組織標本。排除標準：術前接受過放化療治療。手術將患者病變組織切除后，立即在距離腫瘤2 cm位置處切下0.6 cm大小的正常卵巢組織，同時留取同樣大小的癌組織樣本，快速放入冷存管液氮保存，樣本留取過程中注意交叉污染。本實驗經本院倫理委員會批準，所有參與研究患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.細胞來源和培養：人卵巢癌SKOV3細胞株由本實驗室液氮冷凍保存。SKOV3細胞株經取出后，37℃水浴溶解，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，離心去上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種于培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養，融合度到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養基傳代。傳代次數一致且細胞處于對數期，用于后續研究。

2.試劑和儀器：胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養基均購自美國Gibco公司，miR-150-5p inhibitors(抑制劑)和陰性對照質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司代為合成，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，兔抗人cleaved caspase3、PI3K、Akt和p-Akt多克隆抗體、辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG采購自美國Abcam公司，MTT試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒采購自上海經科化學科技有限公司，細胞培養箱和分光光度計購自上海三騰儀器有限公司。

3.qRT-PCR檢測：采用TRIzol試劑提取總RNA，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為95 ℃預變性10 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40 個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。U6作為內參(上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為 5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，miR-150-5p(上游引物為 5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)相對表達量用2-△△CT表示。

4.細胞轉染：調整卵巢癌SKOV3細胞株濃度至1×106個/毫升，取2 ml接種于6孔板中，培養過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的miR-150-5p 抑制劑和陰性對照分別轉染至SKOV3細胞。以人卵巢癌SKOV3細胞株作為空白對照組，轉染miR-150-5p抑制劑的人卵巢癌SKOV3細胞株作為miR-150-5p抑制劑組，轉染陰性對照質粒的人卵巢癌SKOV3細胞株作為陰性對照組。

5.MTT法檢測：轉染48 h后，調整卵巢癌SKOV3細胞株濃度至3×104個/毫升接種于96孔板中，每孔加入200 μl的細胞懸液，置入培養箱中培養，條件為37 ℃、5%CO2，于24 h、48 h和72 h，加入MTT試劑10 μl，37 ℃孕育4 h，檢測490 nm處OD值。細胞增殖率=轉染組OD/空白組OD×100%。

6.流式細胞術檢測：轉染48 h后，PBS洗滌，加入300 μl的緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106個/毫升，取100 μl置于流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻室溫孕育15 min，加入400 μl PBS，上機檢測細胞凋亡情況。

7.生物信息學預測和熒光素酶報告基因分析：通過Targetscan(http://ww w.targetscan.org/)預測miRNA-150-5p與PI3K的靶向結合情況。采用 PCR從大鼠星形膠質細胞基因組 DNA中擴增 PI3K的 3′-非翻譯區(3′-untranslated region，3′-UTR)序列，構建至熒光素酶報告基因載體 pGL3(pGL3-PI3K-WT)中，同時構建突變型重組質粒(pGL3-PI3K-MUT)，將HEK293T 細胞按30%左右密度鋪25孔板，將miRNA-150-5p mimic及mimic control分別與空載質粒及上述質粒共轉染至HEK293T 細胞。轉染后24 h，根據雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

8.Western blotting檢測：取轉染48 h的SKOV3細胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4 ℃離心10 min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100 ℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入Cleaved caspase-3、PI3K(P110亞基)、Akt、p-Akt一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，以GAPDH作為內參。

9.統計學處理：應用SPSS16.0版軟件處理數據。多組間比較采用單因素分析，兩兩比較用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、miR-150-5p在卵巢癌組織和癌旁正常組織中的表達

82例卵巢癌患者癌組織和癌旁正常組織中miR-150-5p的相對表達分別為(1.64±0.10)和(0.99±0.08)，差異有統計學意義，見圖1。

2、轉染后miR-150-5p在卵巢癌SKOV3細胞株中的表達

空白對照組和陰性對照組miR-150-5p的相對表達量分別為(0.97±0.06)和(1.01±0.08)，組間差異無統計學意義；miR-150-5p抑制劑組為(0.11±0.03)，明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義。見圖2。

三、轉染miR-150-5p抑制劑對卵巢癌SKOV3細胞株增殖能力的影響

空白對照組和陰性對照組24 h、48 h和72 h細胞增殖率的差異無統計學意義；miR-150-5p抑制劑組24 h、48 h、72 h細胞增殖率分別為(9.61±1.32)%、(24.54±3.61)%和(33.78±3.72)%，同一時間點均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義。見圖3。

四、轉染miR-150-5p抑制劑對卵巢癌SKOV3細胞株凋亡的影響

空白對照組和陰性對照組細胞凋亡率分別為(0.74±0.10)%和(1.79±0.21)%，差異無統計學意義；而miR-150-5p抑制劑組細胞凋亡率為(16.65±2.93)%，明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義。見圖4。

圖1 miR-150-5p在卵巢癌組織和癌旁正常組織中的表達

Compared with blank control group, *P<0.05;compared with negative control group, #P<0.05

A:flow detection record chart; B:apoptosis rate in different groups

五、PI3K與miRNA-150-5p的作用關系

雙熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miRNA-150-5p后，野生型PI3K的熒光素酶活性被抑制(t=21.354，P=0.000)，突變型PI3K的熒光素酶活性無明顯變化(t=0.323，P=0.684)，說明PI3K與miRNA-150-5P具有靶向調控關系，見圖5。

六、轉染miR-150-5p抑制劑對PI3K、Akt、p-Akt和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

各組細胞轉染后培養48 h，空白對照組和陰性對照組PI3K、p-Akt以及Cleaved caspase-3蛋白表達的差異均無統計學意義；miR-150-5p抑制劑組PI3K、p-Akt蛋白表達顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義；Cleaved caspase-3蛋白明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義；而三組間Akt蛋白表達的差異無統計學意義。見圖6。

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測結果

A:western blotting detection electrophoresis map; B:relative expression of each protein

討 論

卵巢癌發病機制較為復雜，但與其他惡性腫瘤相似，其發生發展與致癌基因、抑癌基因的表達密切相關[6]。miRNA作為單鏈非編碼RNA，長度在21～25 nt，研究報道[7]稱其能夠和靶基因的3′UTR結合，從而調節靶基因的表達或者降解[7-8]。miR-150-5p作為miRNA中的一員，位于人類染色體19q13.33。國外有學者[9]研究發現，肺癌細胞中miR-150-5p異常高表達，且其能夠下調p53表達，從而影響細胞表型。還有學者[10]發現，胃癌組織和細胞株中miR-150-5p均處于高表達狀態。Inoue等[11]學者通過QPCR檢測胃癌組織中miR-150-5p的表達，結果顯示其在胃癌中異常高表達。

RNA干擾主要是通過雙鏈DNA將特定基因進行沉默，其具有毒性小，抑制率高的特點，目前主要用來研究功能基因生物學特性。有學者[12]采用RNA干擾技術下調鼻咽癌細胞中miR-150-5p表達，結果癌細胞的侵襲能力也明顯下降。還有學者[13]在多發性骨髓瘤中采用RNA干擾技術沉默miR-150-5p的表達，結果顯示細胞凋亡增強，增殖能力減弱。本研究也采用小分子RNA干擾miR-150-5p在卵巢癌細胞株SKOV3中的表達，結果顯示，miR-150-5p抑制劑組24 h、48 h和72 h細胞增殖率均明顯低于空白對照組和陰性對照組。轉染48 h，miR-150-5p抑制劑組細胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組，提示miR-150-5p在卵巢癌的發生、發展過程中可能扮演促癌基因的角色。

文獻報道[14]稱miRNA主要是通過與靶蛋白結合來發揮生物功能，本研究首先采用生物信息學TargerScan數據庫檢索顯示miR-150-5p與PI3K存在靶向結合位點，雙熒光素酶報告基因結果也顯示二者存在靶向調控關系。國內有學者[15]在結腸癌細胞中研究發現，沉默biaoda miR-150-5p，PI3K表達水平也明顯降低，結腸癌細胞凋亡能力增強。本研究結果也顯示抑制卵巢癌細胞SKOV3中miR-150-5p的表達后，PI3K表達量明顯下調，細胞增殖能力下降，凋亡能力增強。

PI3K/Akt作為經典的信號通路，在細胞遷移、分化和凋亡過程中起著重要作用[16]。研究報道稱PI3K能夠通過PDK1促使Akt發生磷酸化，進而上調caspase表達，而caspase可將自身底物水解傳遞至凋亡通路，進而導致細胞出現程序性死亡，Cleaved caspase 3 作為caspases 級聯反應中關鍵蛋白，在凋亡過程中扮演著極其重要角色[17]。有學者[18]發現，肺癌細胞中Cleaved caspase 3表達明顯下降，而加入了 PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002干預之后，Cleaved caspase 3蛋白水平明顯升高，細胞凋亡率顯著提高。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測 PI3K/Akt/caspase 3關鍵蛋白表達，結果顯示miR-150-5p 抑制劑組SKOV3細胞中Akt的磷酸化程度明顯下降，Cleaved caspase 3蛋白表達明顯升高，提示miRNA-150-5p調卵巢癌增殖、凋亡可能是通過調節PI3K/Akt/Cleaved caspase 3 信號通路實現的。

綜上所述,miR-150-5p在卵巢癌中作促癌基因，其調控作用可能與PI3K/Akt信號通路有關。