2-脫氧葡萄糖聯合奧希替尼對非小細胞肺癌細胞株H1975耐藥性、糖酵解水平表達和增殖活性的影響*

胡海峰，雒小佳

延安大學附屬醫院腫瘤科二病區，陜西延安 716000

肺癌是我國發病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌患者的80%，約75%的患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低，患者生存時間和生活質量亟待提高[2-4]。奧希替尼在國內獲批的適應證是既往使用表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療時或治療后出現疾病進展，并且經檢驗確認存在EGFR T790M 突變陽性的局部晚期或轉移性成人NSCLC[5]。奧希替尼已經成為各大指南推薦的首選靶向藥，可延長肺癌患者生存時間[6]。但是奧希替尼也存在腫瘤耐藥的問題，一旦出現腫瘤耐藥，奧希替尼的療效就明顯下降，肺癌開始加重。2-脫氧葡萄糖是天然抗代謝物類抗菌藥物，具有能夠抑制病毒感染、酵母發酵、病菌及腫瘤細胞生長等多種生理藥理效應[7]，具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗癲癇、抗衰老等作用，用于預防病毒及病原菌感染等，可防治單純皰疹病毒(HSV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒等病原菌引起的傳染病，主要用于各種畜禽病毒病、免疫抑制病的預防和治療，也可用于細菌及支原體感染的輔助治療，在醫藥及化妝品等行業具有廣泛的應用前景[8]。因此，本研究探討2-脫氧葡萄糖聯合奧希替尼對NSCLC細胞株H1975耐藥性、糖酵解水平表達情況的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 將NSCLC細胞株H1975(美國國家細胞庫)經過體外誘導處理48 h后，37 ℃，建立奧希替尼(0.5 μmol/L)繼發性耐藥NSCLC細胞株H1975-OR[9]。

1.2方法 用流式細胞分析儀檢測藥物處理后的細胞凋亡率，評估藥物的促凋亡能力。

1.2.1MTT 法檢測不同細胞對奧希替尼的敏感性[10](1)MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT水平為5 mg/mL。因此，可以稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)或無酚紅的培養基中，用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放置于4 ℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。(2)配制MTT時用PBS(pH=7.4)溶解。(3)PBS配方：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g調pH為7.4，定容1 μL。(4)收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板使待測細胞密度調整為1 000～10 000/孔。(5)5%的CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物。一般5～7個梯度，每孔100 μL，設3～5個復孔。(6)5%的CO2，37 ℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。(7)每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液。(8)終止培養，小心吸去孔內培養液。(9)每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀波長490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。(10)同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。細胞存活率=藥物處理組A值/對照組A值×100%。

1.2.2siRNA細胞轉染[11](1)提前1 d將細胞種植在24孔板中，以轉染時細胞匯合度在30%左右為宜，轉染前全培養基總量為0.45 mL。(2)取0.67 g(50 pmol)的siRNA，加入一定量無血清稀釋液，充分混勻，制成RNA稀釋液，終體積為25 μL。注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640培養基。(3)取1 L的EntransterTM-R4000，然后加入24 μL無血清稀釋液體，充分混勻，制成EntransterTM-R4000稀釋液，終體積為25 μL。室溫靜置5 min。(4)將EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合(可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上)混合，室溫靜置15 min。轉染復合物制備完成。(5)將50 L轉染復合物滴入0.45 mL全培養基(可含10%血清和抗菌藥物)的細胞上，前后移動培養皿，混合均勻。注意：采用含血清的全培養基有助于提升轉染效率。(6)轉染后6 h觀察細胞狀態，如狀態良好可不必更換培養基，繼續培養24～96 h得到結果。

1.2.3糖酵解水平的檢測 采用比色法檢測細胞外乳酸濃度。將細胞株H1975-OR、細胞株H1975接種于96孔板(104/孔，100 μL)，待細胞貼壁后加入奧希替尼處理48 h。收集細胞和培養基，參照試劑盒說明書進行操作，檢測培養基中的乳酸濃度。

1.2.4CCK-8法檢測細胞的耐藥性 取對數生長期細胞株H1975-OR、細胞株H1975單細胞懸液接種于96孔板，3×103/孔；培養24 h后，加入含相應濃度奧希替尼的培養液每孔200 μL，每個藥物濃度設5個復孔；繼續培養72 h，仔細吸棄各孔培養液，每孔加入RPMI 1640培養基100 μL和CCK-8試劑10 μL，繼續培養1 h；在酶聯免疫吸附法檢測儀上于490 nm波長下檢測各孔的A值，采用Graphpad Prism 6.0軟件計算各組細胞的半數抑制濃度(IC50)。

2 結 果

2.1細胞株H1975-OR與細胞株H1975對奧希替尼的敏感性 細胞株H1975-OR對奧希替尼的敏感性為(0.95±0.18)μmol/L，低于細胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2奧希替尼對細胞株H1975-OR和細胞株H1975增殖活性的影響 采用同一水平的奧希替尼(3 μmol/L)處理細胞株H1975-OR和細胞株H1975，細胞株H1975-OR增殖活性被抑制程度低于細胞株H1975。見圖1。

圖1 細胞株H1975-OR和細胞株H1975在奧希替尼作用后的細胞存活曲線

2.3細胞株H1975-OR與細胞株H1975糖酵解水平比較 細胞株H1975-OR的糖酵解水平為(20.87±0.86)mmol/L，低于細胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.42-脫氧葡萄糖可逆轉細胞株H1975-OR對奧希替尼的耐藥性 當2-脫氧葡萄糖的水平為4 mmol/L時，細胞株H1975-OR對奧希替尼的IC50值為(1.39±0.11)μmol/L，與奧希替尼敏感細胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L相似。

2.5奧希替尼對細胞株H1975-OR抗增殖效果 細胞株H1975-OR的細胞存活率如下：G1期，(0.046±0.020)%；G2期，(0.178±0.028)%；G3期，(0.395±0.082)%；G4期，(0.724±0.048)%。

3 討 論

自工業時代以來，肺癌的發病率和病死率逐年上升，且速度極為驚人。肺癌是目前中國惡性腫瘤中病死率最高的一種癌癥[12]。NSCLC相對于小細胞肺癌，發病慢，癌癥的擴散速度較慢，但是一般發現即是晚期，非常難以控制和治療?；颊咴谠缙诔霈F肺部癥狀時，就應該及時就醫，以提前預防和干預治療[13-14]。NSCLC主要包括鱗癌、腺癌、大細胞肺癌，與小細胞癌相比，癌細胞生長分裂較慢、擴散轉移相對較晚。根據最新的統計結果顯示，大多數的患者在發現的時候就已處于中晚期，治療相對不易，存活率也不高[15]。NSCLC的發病原因主要有吸煙、職業暴露所致、環境接觸、電離輻射、既往肺部慢性感染、遺傳等因素，其中吸煙是肺癌成因中最重要的一種因素，因為香煙中含有大量對肺部有害的物質，長期吸煙，對肺部的損傷是不可逆的?？傊?，NSCLC由于病情發展較慢，較容易延誤治療，患者在出現早期疑似癥狀的時候，就應該及時去正規醫院進行診斷，通過X線檢查、支氣管鏡檢查、細胞學檢查等現代醫療手段，進行確診，如果確定是肺癌，也要保持積極樂觀的心態，進行治療干預，防止病情的進一步惡化[16]。

目前隨著多項臨床研究的開展，奧希替尼已被推薦用于肺癌的一線治療。在對奧希替尼耐藥的患者進行的基因檢測中，H1975繼發突變是常見的耐藥突變，占15%～20%[17-18]。分順式突變和反式突變，多以順式突變為主。但奧希替尼是一種靶向藥物，該藥耐藥之后如何用藥對于患者至關重要，因此本研究探討2-脫氧葡萄糖聯合奧希替尼對NSCLC患者細胞株H1975耐藥性、糖酵解水平的影響[19]。

2-脫氧葡萄糖的一種衍生物是一種抗代謝物，也是正粘病毒、副粘病毒及皰疹病毒囊膜的重要組成成分，具有干擾病毒特異性糖蛋白的合成，有效抑制皰疹單病毒、RNA和DNA包膜病毒、乳腺癌細胞增殖等功效。

本研究結果顯示，細胞株H1975-OR對奧希替尼的敏感性為(0.95±0.18)μmol/L，低于細胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L(P<0.05)。細胞株H1975-OR的糖酵解水平為(20.87±0.86)mmol/L，低于細胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L(P<0.05)。當2-脫氧葡萄糖水平為4 mmol/L時，細胞株H1975-OR對奧希替尼的IC50值為(1.39±0.11)μmol/L，接近奧希替尼敏感細胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L。奧希替尼對細胞株H1975-OR作用后，細胞存活率如下：G1期，(0.046±0.020)%；G2期，(0.178±0.028)%；G3期，(0.395±0.082)%；G4期，(0.724±0.048)%。

綜上所述，2-脫氧葡萄糖逆轉NSCLC細胞對奧希替尼的繼發性耐藥，其機制與抑制細胞糖酵解進而誘導凋亡增加有關。