利用SNP分子標記構建50份糯玉米自交系DNA指紋庫

韓 晴，孫小淋，盧 媛，田 東，施 標，沈雪芳*

(1上海市農業科學院作物育種栽培研究所，CIMMYT：中國特用玉米研究中心，上海 201403；2上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海201403)

糯玉米(ZeamaysL.var.ceratinaKulesh)是玉米屬的一種類型，起源于中國[1]，富含支鏈淀粉、賴氨酸、蛋白質等營養物質，具有良好的適口性且營養豐富，深受廣大消費者和食品加工企業的歡迎。近年來，通過國家審定的糯玉米品種數量越來越多，其種植面積不斷增加，同時也出現套牌侵權、偽劣假種等現象，嚴重影響種業健康持續發展[2]。

早期的品種鑒別主要依靠形態學方法，這種方法易受人為和環境的影響。隨著分子生物學的發展，出現了分子標記技術如RFLP、AFLP、SSR等，該技術不受環境影響，鑒別周期短，被廣泛應用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、DNA指紋庫構建等。王鳳格等[3]利用40對核心SSR引物分析了328個玉米品種的遺傳多樣性，發現育成的品種遺傳多樣性指數在不同年份間變化不大。盧媛等[4]利用29對SSR標記對87份糯玉米自交系進行遺傳多樣性分析，并將其劃分為4大類群，各個類群包含種質不同。常利芳等[5]利用40對SSR標記對56份超甜玉米和88份普甜玉米進行聚類分析，共篩選出14個超甜玉米和19個普甜玉米兩個亞群體種質，這兩個亞群核心種質保留了原始群體的遺傳多樣性和表型變異，能夠代表原始甜玉米材料群體。但采用SSR等分子標記技術構建玉米品種DNA指紋庫普遍存在檢測位點數量少、標記數量有限和位點突變率高等缺點。SNP標記作為繼AFLP、SSR標記后的第三代分子標記，具有分布廣泛、呈二態性、通量高、遺傳穩定性強和易于自動化分析等優點，已被國際植物新品種權保護聯盟(UPOV)推薦用于DNA指紋數據庫的構建[6]。目前，SNP標記已應用于油菜[7]、甘藍[8]、海島棉[9]等作物指紋庫的構建和作物的分子標記輔助育種中[10]，但SNP標記在糯玉米DNA指紋庫中的應用很少。本研究利用SNP標記對糯玉米自交系進行基因型分析，并利用核心SNP標記構建糯玉米自交系的DNA指紋庫，同時對糯玉米自交系類群進行聚類分析，以期為糯玉米品種確權、遺傳多樣性分析和育種者權益保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為50份糯玉米自交系，由上海市農業科學院玉米遺傳育種課題組提供。編號為1—50，品系名稱、系譜來源及籽粒性狀見表1。

表1 50份供試糯玉米自交系

1.2 DNA提取

將50份自交系種植在人工氣候培養箱中，生長到兩葉一心時取幼苗葉片。每個品系取5株，混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，TIANGEN DP320)提取幼苗DNA，具體流程參照試劑盒說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取樣品DNA質量進行檢測，要求主帶明顯、單一，保證DNA的A260/A280值在1.8—2.2。樣品DNA置于-20℃保存備用。

1.3 基因分型

利用Illumina公司研發的包含56 110個SNP標記(Illumina，San Diego，California,U.S.A)對供試材料進行基因型分析，按照芯片操作手冊進行DNA處理、DNA與芯片雜交、洗脫、單堿基延伸等步驟，將原始數據導入GenomeStudio 軟件(V2 011.1，Illumina，Inc.)進行SNP 分型。

用tassel 5.0軟件對試驗材料基因型進行統計，包括樣品的缺失率、雜合率以及SNP的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency，MAF)，選出位點檢出率大于95%、最小等位基因頻率大于0.01、雜合率小于0.05的共42 406個SNP標記用于后續分析。利用位點篩選工具LociScan_V1.0對位點進行梯度篩選。

1.4 聚類分析

用tassel 5.0軟件計算各品系之間的遺傳距離和遺傳相似度，利用NTSYSpc 2.1軟件和UPGMA算法進行聚類分析[11]。

2 結果與分析

2.1 SNP標記的分析

利用篩選得到的42 406個SNP標記對50份糯玉米自交系進行SNP分型。99%的位點檢出率大于95%，94%的位點檢出率超過97%(圖1)。說明該芯片對糯玉米自交系SNP位點具有較高的分型效率。42 406個SNP位點在50份糯玉米自交系的雜合率為2%—9%，平均4%，說明自交系純合度較高；SNP缺失率為0—13%，平均1%，說明SNP芯片質量好；最小等位基因頻率(MAF)為0.05—0.55，平均0.40；多態性信息含量(PIC)在0.12—0.46，平均0.38?；蚨鄻有灾笖底兓秶鸀?.15—0.65，平均0.44。

2.2 DNA指紋庫的構建

分別選用8個不同的數量位點，即7 000、8 000、9 000、 10 000、25 000、30 000、35 000、40 000，統計分析位點的識別率。發現這些位點MAF在0.41及以上，雜合率在0.05及以下，PIC在0.31及以上。隨著位點數的增加，識別率也越來越高。當達到10 000位點時，識別率為95%；當達到25 000位點時，識別率為98%，以后趨于平緩(表2)。25 000位點時的雜合率0.03，MAF為0.42，PIC均值0.35，98%的糯玉米材料可以被有效區分開。因此，最終選擇25 000個核心SNP位點組合構建50個糯玉米品種DNA指紋庫(本文未列出)。

表2 SNP核心位點的篩選

2.3 聚類分析

50份自交系兩兩之間的相似系數在0.38—0.93。18SW-中(編號38)與B紅(編號41)、19SW-恒(編號4)與19SW-35(編號5)之間相似系數最大，為0.925，二者之間有6 875個位點的差異。說明18SW-93(編號23)與18SW-OP(編號28)之間親緣關系要遠；18SW-中(編號38)與B紅(編號41)、19SW-恒(編號4)與19SW-35(編號5)之間親緣關系要近。在玉米育種實踐中，應盡量避免將親緣關系近的自交系配組。

在相似系數0.65處，50份糯玉米自交系劃分為4大類群。第Ⅰ大群包括19SW-玉、19SW-萬、19SW-張、19SW-18、18SW-52等12個糯玉米自交系；第Ⅱ大群包括19SW-恒、19SW-35、19SW-恒6、19SW-蘇科、18SW-江恒等11個糯玉米自交系；第Ⅲ大群包括19SW-紅、19SW-48、19SW-75、18SW-H、18SW-OP等14個糯玉米自交系；第Ⅳ大群包括19SW-玉、19SW-31、18SW-甜糯、18SW-彩甜糯、申-3等13個糯玉米自交系。聚類結果與各類群的籽粒顏色表現和系譜來源均一致，如第一大類群籽粒顏色均為白色，組合父本為‘萬糯2000’；第二大類群籽粒顏色均為紫白色，組合父本為‘恒♀-2’；第三大類群籽粒顏色均為紅色，組合父本為‘紅w’；第四大類群籽粒顏色均為五彩色，組合父本為‘w93’。

3 討論與結論

SNP分子標記技術被國際植物品種權保護聯盟指定為構建DNA指紋數據庫的標記方法之一，具有與功能基因關聯度高、自動化程度高、樣品檢測通量高等優點?，F在已經被廣泛用于玉米DNA指紋庫的構建、遺傳距離和遺傳相似度的分析[12]。

目前，在玉米研究中應用比較多的SNP標記有600K、50K、5K、3K、1K等，SNP標記在基因組中密度高且分布均勻，是最具發展潛力的建庫標記之一[13-14]。本研究采用的Illumina公司開發的包含56 110個SNP標記屬于高密度SNP標記。通過軟件計算得出所選SNP標記的PIC均值為0.35，按照PIC>0.5為高度多態性；0.25

通過設置8個不同數量位點梯度篩選核心標記，可節約檢測成本，提高品種鑒別的準確度。梯度篩選分析表明，當數量位點為7 000時，供試材料的識別率就可達85%，對于親緣關系較遠的品種，可選擇7 000個SNP位點結合定點測序的方法進行鑒定；當數量位點達到25 000時，供試材料間的識別率高達98%，對親緣關系較近的品種，需要結合高通量測序技術進行區分。本研究篩選SNP核心位點組合，可為糯玉米自交系指紋庫構建、遺傳多樣性分析和種質資源評價等研究提供參考依據。

聚類結果表明，50份糯玉米自交系被劃分為四大類群。通過系譜分析和農藝性狀比較，發現聚類結果與系譜來源較一致。如品系18SW-中與18SW-56籽粒顏色都是紅色，穗型都是筒錐型，株型一致；品系18SW-中與18SW-56的父本是同一個父本，都是‘紅w’。說明SNP標記技術能夠根據親緣關系遠近，準確劃分糯玉米自交系。