林 鷙,何錫忠,潘 潔,朱永軍,彭麗英
(上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海201106)
豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性傳染病,臨床特征為動物發熱、奇癢及繁殖障礙,成年豬隱性感染從而造成長期帶毒排毒等[1]。PRV基因組為GC含量高達70%以上的線狀雙鏈DNA,編碼100多種蛋白。TK基因是豬偽狂犬病毒復制增殖的非必需基因,同時也是主要的毒力基因,對PRV毒力的影響最大,其編碼的胸苷激酶參與病毒的復制和潛伏感染,對病毒在神經組織中的增殖具有重要作用[2-4]。
2011年以來,我國暴發了一種由豬偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病,主要造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡。接種傳統的偽狂犬病疫苗已不能抵御偽狂犬病毒變異毒株的侵襲[5-6]。不同學者在不同的地區都分離到了流行的變異毒株[7-10]。本實驗室也從發病豬腦中分離到了一株豬偽狂犬病毒,并命名為SX株,本試驗擬利用PCR對該毒株的TK基因進行擴增和測序,并與國內外經典毒株、疫苗毒株以及近些年的變異毒株進行序列比對,以期了解豬偽狂犬流行變異毒株TK基因的結構特征及分子流行病學特點。
豬偽狂犬病毒SX株由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所分離所得。ST細胞由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所保存。
病毒DNA/RNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產品;Ex Taq DNA 聚合酶、DL5000 DNA Marker等均為生工生物工程(上海)股份有限公司產品。
根據GenBank上已公布的序列設計針對TK基因的特異性引物,上游引物F:GCACCCCGAGGTTGACTTCA;下游引物R:AGGGTCACACCCCCATCTCC。擴增片段大小預計為1 125bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
收集病變達到80%以上的ST細胞,反復凍融3次,12 000r/min離心后,取200 μL上清,利用試劑盒提取病毒DNA。利用1.3節的引物擴增PRV的TK基因。PCR反應體系:病毒DNA模板 2 μL,PCR mix 25 μL,上游引物F 2.5 μL,下游引物R 2.5 μL,ddH2O 18 μL,總體積50 μL。反應程序:95 ℃ 變性5 min; 95 ℃ 60 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,35 個循環; 72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,其余產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。
采用DNAStar軟件將測序得到的SX株TK基因核苷酸序列及推導出的氨基酸序列與GenBank上9株國內外PRV分離株的相應序列進行同源性比對分析和進化樹分析。9株國內外分離株分別為來自中國的變異毒株HeN1株、JS2012株、TJ株、GD株、經典毒株Ea株,匈牙利的Kaplan株和疫苗毒株Bartha株,美國的Becker株以及希臘的Kolchis株。
用設計的特異性引物進行PCR擴增之后,產物在瓊脂糖凝膠電泳上有一條特異性的條帶,約1 100bp(圖1),大小與預期結果相符。
PCR產物測序顯示,目的片段包括了TK基因的編碼區序列,長度為963bp,共編碼320個氨基酸。將得到的序列結果與GenBank中已知的其他毒株TK基因核苷酸序列進行比對發現(圖2),SX株的TK基因序列與近些年國內分離得到的流行毒株TK基因序列同源性為100%;與經典毒株Ea株的同源性為99.6%,存在4個堿基的變異,分別為:第13位由A突變為C,第643位和第644位由A和C突變為G和T,第851位由C突變為T(圖3);與疫苗毒株Bartha株的同源性為99.7%,存在以下變異:第643位和第644位堿基由A和C分別突變為G和T,第851位堿基由C突變為T(圖3);與國外的Becker、Kaplan、Kolchis毒株的同源性分別為99.6%,99.7%和99.4%。與Becker毒株的同源性和Ea株相同;與Kaplan毒株相比存在3個堿基的變異:第57位T突變為G,第643和第644位由A和C突變為G和T;與Kolchis毒株相比存在5個堿基的突變:第163位G突變為A,第513位A突變為G,第643位和第644位由A和C突變為G和T,第810位A突變為G(圖3)。
結果顯示(圖4):SX株TK基因編碼的氨基酸與近幾年分離得到的流行毒株的TK基因編碼的氨基酸同源性為100%。與國內經典毒株Ea株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.4%,存在2個氨基酸的突變(圖5):第215位的蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V),第284位的丙氨酸(A)突變為纈氨酸(V);與國外毒株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.1%—99.7%;與Bartha株、Becker株相比存在2個氨基酸的突變:第215位的蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V),第284位的丙氨酸(A)突變為纈氨酸(V);與Kaplan株相比只存在1個氨基酸的突變,即第215位的蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V);與Kolchis株相比存在3個氨基酸的突變(圖5):第55位的丙氨酸(A)突變為蘇氨酸(T),第215位的蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V),第293位蘇氨酸(T)突變為丙氨酸(A)。
利用DNAstar軟件繪制進化樹,從圖6可看出,SX株與近些年國內分離得到的流行變異毒株在一個分支上,與國內經典毒株Ea株、疫苗株Bartha株以及國外其他毒株呈現各自獨立的遺傳進化分支。
已有研究表明,TK基因屬于PRV的早期基因,也是主要的毒力基因,TK基因雖然是PRV復制的非必需基因,但是對病毒在神經組織中的增殖具有重要作用。缺失了TK基因的病毒很難在神經元中增殖,同時也降低了病毒的嗜神經毒性和毒力[2-4]。因此,對TK基因的序列進行比對分析,在某種程度上可以反映出PRV的毒力強弱,有助于在分子水平上分析PRV 致病的分子機理。
本試驗參考GenBank中已知的PRVTK基因及相近的序列,設計特異性引物擴增了TK基因的全長,測序顯示TK基因的編碼區為963個堿基,編碼320個氨基酸。與國內外不同毒株比對顯示,SX株TK基因序列與近些年分離到的變異毒株(HeN1、JS2012、TJ、GD)核苷酸和氨基酸均完全一致,同源性為100%;與國內經典毒株Ea株核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%和99.4%;與國外的毒株(Bartha、Becker、Kaplan、Kolchis)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.4%—99.7%和99.1%—99.7%。對比近些年國內流行的變異毒株TK基因與國內經典毒株及國外毒株TK基因氨基酸序列發現,存在的突變位點雖然不多,但是大部分都出現了第215位由蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V)和第284位由丙氨酸(A)突變為纈氨酸(V),這兩個位點值得注意,可能這兩個位點的突變是目前國內流行的變異毒株TK基因重要的分子特征之一。此外,TK基因有2個非常重要的結構域,即ATP結合結構域和核苷酸結合結構域,分別位于10—18位和108—110位[12],這些核心區域都沒有發生突變。由此可以看出,不管是核苷酸序列還是氨基酸序列,不同毒株之間存在一定的變異,但是同源性還是很高的,說明PRVTK基因具有較高的保守性。
本試驗對PRV SX株的TK基因分子特征進行了初步的分析,可以為PRV分子流行病學調查、TK基因的功能研究及病毒基因組改造等提供參考。