基于OBE理念的藥物化學生物學實驗教學案例設計

黃 瑾，徐仲玉，岳嶺佳

（華東理工大學藥學院，上海200237）

0 引 言

成果導向教育理念（Outcomce Based Education，OBE）自1981 年提出以來便得到了教育工作者的廣泛重視與認可，已成為歐美等發達國家教育改革的主流理念，其以產出為導向，要求學生具備分析和解決復雜問題的能力、創新意識和團隊合作精神。新形勢下我國藥學專業高等教育的任務是培養具有創新精神和實踐能力的高級藥學專門人才，其中創新以知識為基礎，思想為關鍵，實踐為根本。藥物化學生物學是現代化學與生命科學交叉產生的新興學科，通過使用化學小分子干預疾病發生發展的過程，為發現新藥提供理論依據［1-3］，是新形勢下本科藥學專業的核心課程，這一課程對知識、思想和實踐的綜合強化與當前主流教育理念和培養目標不謀而合。目前，我校藥學專業已開設了藥物化學生物學課程。為契合培養具有扎實的藥學專業基礎知識和藥學實踐能力的培養目標，體現從基因到藥物，理工結合、教研結合的專業特色，及時跟蹤學科發展的最新成果，將科研成果及科研心得引入教學實踐中，完善更新藥物化學生物學課程教學內容［4］。

從分子水平上詳細了解并闡明小分子藥物與靶蛋白的相互作用，是現代藥物化學生物學研究的重要內容之一。該研究有助于更加深入、清晰地認識各種藥物在生物體內的藥理活性及其作用方式，同時也可為篩選藥效更顯著、毒副作用更小的新型藥物提供科學依據［5］。

小分子化合物與靶標蛋白相互作用的識別是開發靶向候選藥物的一個重要起點［6］，蛋白質熱漂移實驗（Protein Thermal Shift Assay，TSA），也叫差示掃描熒光檢測實驗（Differential scanning fluorimetry，DSF），是檢測目標蛋白熱穩定性的熱變性實驗，也是一種經濟實用、方便快捷確證活性小分子與靶蛋白相互作用的實驗手段。不同小分子化合物對蛋白的熱穩定性影響不同［7］，通過TSA法檢測加入小分子化合物后靶標蛋白熔解溫度的變化（ΔTm），可判斷小分子化合物對蛋白的作用強弱，進而篩選出可有效結合靶蛋白的小分子化合物［8］。

1 蛋白質熱轉移法

1.1 實驗原理

蛋白的Tm值（熔解溫度）對確定蛋白的結構特征、穩定性及蛋白-配體間相互作用具有重要意義。配體與靶標蛋白結合后，通常能增強靶標蛋白的穩定性，使靶標蛋白的Tm值發生改變（ΔTm）。Tm值的改變源于配體與受體蛋白間的結合能（ΔGbind），可通過蛋白質熱漂移實驗進行測定［9］，其原理如圖1 所示。

通常蛋白質處于一種折疊的狀態，其疏水部分藏于蛋白內部。SYPRO Orange 是一種在水溶液中幾乎不發光、與蛋白疏水性表面結合后可產生熒光的染料分子［10］。當目標蛋白所處溶液體系溫度緩慢升高時，目標蛋白隨溫度升高解開折疊并逐漸暴露出疏水表面，疏水表面非特異性地結合SYPRO Orange 染料，導致體系熒光信號強度上升。當溫度達到某一臨界點時，展開的蛋白質鏈聚集，阻止熒光染料結合，被阻止的熒光染料重新回到周圍的水環境中，導致高溫下熒光淬滅，熒光信號強度下降。通過檢測體系中熒光信號的變化，可得出目標蛋白的熔解曲線，并計算出蛋白的Tm值（Tm值為熔解曲線增色效應達到最大值一半時的溫度）。加入化合物后若目標蛋白的Tm值出現明顯增加（一般升高至少2 ℃以上），則說明該化合物能與目標蛋白結合并穩定其構象［11］，如圖2 所示。

圖1 配體誘導蛋白質的構象變化示意圖

圖2 蛋白質熱轉移法原理

2 實驗內容

2.1 實驗材料、主要試劑與儀器

2.1.1 實驗材料

法尼醇X 受體的羧基末端配體結合區（FXRLBD）（北京百諾威生物科技有限公司），96 孔定量PCR板（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司）。

2.1.2 實驗試劑

SYPRO Orange 5000X（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），鹽酸小檗堿Berberine Hydrochloride（上海詩丹德有限公司），伊維菌素Ivermectin（上海詩丹德有限公司），Tris-Hcl（國藥集團化學試劑有限公司），NaCl（國藥集團化學試劑有限公司），乙二胺四乙酸EDTA（國藥集團化學試劑有限公司），二硫蘇糖醇DTT（國藥集團化學試劑有限公司），二甲基亞砜DMSO（上海泰坦科技有限公司）。

2.1.3 實驗儀器

熒光實時定量PCR 儀（Bio-Rad 上海有限公司），Eppendorf移液器（艾本德（中國）股份有限公司）。

2.2 實驗操作流程

TSA實驗主要是在96 孔定量PCR板中利用熒光實時定量PCR 儀完成平行檢測。實驗反應體系相對簡單，包括蛋白緩沖液，蛋白質樣品，SYPRO Orange以及配體化合物。實驗的具體操作流程如圖3 所示。

圖3 蛋白質熱轉移法的實驗操作流程

2.3 樣品溶液配置

以穩定性較高的代謝類疾病重要靶標法尼醇X受體FXR為目標蛋白，分別選擇無活性的鹽酸小檗堿（Berberine Hydrochloride）及高活性的伊維菌素（Ivermectin）［12］兩種化合物開展實驗，用二甲基亞砜（DMSO）配置成5 mmol/L 的化合物母液備用。按以下比例配置實驗所需的活性測試液（10 mmol/L Tris，10 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，pH 8.0）50 mL，0.22 μm 濾膜過濾后備用，用活性測試液將熒光染料SYPRO Orange稀釋1000 倍待用。將實驗樣品分為3 組，一組空白組（檢測蛋白本身的Tm值）以及兩個化合物組，每組設置3 個平行。為減少同一樣品的測試誤差，可將3 個平行孔的染料、蛋白和化合物預先在1.5 mL 離心管中配制混合液150 μL，包括已稀釋好的染料溶液141 μL，化合物1.5 μL（終濃度為50 μmol/L），以及蛋白7.5 μL（終濃度5 μmol/L），按40 μL/孔分裝到PCR 板內用封條把PCR 板封緊，在4 ℃條件下1 000g，離心2 min 使孔內無氣泡，再放入Bio-Rad CFX96 型RT-PCR儀中。

2.4 PCR程序設置

在熒光實時定量PCR 儀上打開Bio-Rad 軟件，新建一個測試程序，在新程序中插入Melt Curve，調整溫度檢測范圍為25 ～90 ℃，每18 s上升0.3 ℃，調整樣品體積的參數為40 μL。點擊next，選擇Edit Selected，將Scan Mode改為Fret；點擊next，然后對準孔槽放入樣品，關上蓋子，啟動程序。

2.5 結果分析

在實驗原理部分已知通過實時監測熒光信號即可以觀察到蛋白的熱穩定性狀態。如果蛋白結合某一化合物后Tm值發生變化，當ΔTm升高2 ℃以上時，表明該化合物對受體蛋白有結合。在Bio-Rad 軟件程序運行結束后，軟件會自動分析直接可得到蛋白的Tm值。由圖4 可以看到，只有陽性化合物伊維菌素顯著提高了FXR-LBD的熱穩定性，鹽酸小檗堿對FXR-LBD 的熱穩定性無影響。

圖4 伊維菌素對FXR-LBD熔解溫度的影響

為進一步探索化合物濃度對蛋白穩定性的影響，將伊維菌素用DMSO配置成不同濃度，使其在體系中終濃度分別為1、10、25、50、100 μmol/L，用上述方法分別測定不同濃度的伊維菌素對FXR-LBD 蛋白熔解曲線的影響，計算得到Tm值，如圖5 所示。檢測結果顯示，隨著化合物濃度的增高，蛋白的熱穩定性升高。

圖5 不同濃度的伊維菌素對FXR-LBD的熱穩定性的影響

3 實驗注意事項

從實驗溶液配制分裝技巧、體系中顆粒和細菌控制以及平行操作3 個角度總結了整個實驗需要注意的事項。

實驗操作中溶液的配制和分裝是重要環節，溶液的混勻操作對整個實驗的準確性至關重要。實驗中涉及多管反應配制混合液，可先將各組分在1.5 mL EP管中混合均勻后再分裝到96 孔定量PCR 板中；涉及濃度梯度稀釋時，務必將高濃度溶液混合均勻后再進行稀釋。

反應溶液中的顆粒和細菌會對測試體系的澄清度及蛋白質穩定性造成影響，從而影響整個實驗的準確性，故實驗過程中用到所有溶液，配制完成后均須用0.22 μm的濾頭過濾，除去不溶性顆粒物及細菌，方能使用［13］。為了避免不同體系交叉污染，實驗過程中所用的槍頭，96 孔板，離心管等均為一次性使用，切勿重復利用。

為了提高實驗結果的可靠性，每組樣品設置至少3 個復孔及未加入化合物的陰性對照，對數據進行嚴格校正以消除誤差［14］。設置陰性對照可幫助準確判斷實驗中所用的蛋白，染料，緩沖液等是否變質，避免因實驗體系污染產生的錯誤實驗結果。

4 教學討論

本實驗項目有較強的連貫性和綜合性，且實驗成本較低，受眾面較廣，適合作為藥物化學生物學實驗教學環節的綜合性實驗開設。不同于基礎性驗證實驗，熱穩定性檢測靶標蛋白與小分子化合物的相互作用模擬了一個小型研究課題，整體實驗設計以學生為主，讓學生以小組協作形式自行設計實驗細節及操作實驗，給予學生更多的自主空間，團隊協作討論，充分激發學生的主觀能動性和團隊協作精神。在實驗結束后，師生一起對實驗過程中出現的問題及實驗結果進行討論和點評，使學生進一步系統全面地掌握科研中常用的蛋白質熱轉移法實驗，對培養學生的藥物創新思維、團隊協作精神提高科研能力具有重要的意義［15］。

在本實驗過程中熔解曲線可能會出現如下問題，經過師生討論進行了進一步的拓展：① 無熔解曲線：并非所有蛋白質都能在熱變性時有理想的熔解圖譜，約15% ～20%的重組蛋白沒有理想的變性曲線，其常見的原因包括：蛋白本身缺乏緊密的球形折疊，缺少疏水核心或在室溫下穩定性差，熱遷移實驗不適用于檢測存在以上情況的靶標蛋白質與化合物的相互作用分析。②熔解曲線不光滑：在蛋白質熱遷移的實驗過程中，緩沖液溫度會緩慢上升，實驗前應提前明確蛋白緩沖液隨溫度升高pH 值變化的情況［16-17］，需選擇溫度升高對測試體系pH 值影響較小的緩沖液條件。此外，還可以通過改變一些參數來改變熔解曲線不光滑的情況，如SYPRO Orange染料的濃度，緩沖液的配方及蛋白的濃度等，尋找目標蛋白最佳熔解曲線測試條件。③熔解曲線出現多個峰：當蛋白質含有不止一個結構域或形成低聚物時，熔解曲線可能會出現多個峰，這時不能準確得到蛋白的熔解溫度?？赏ㄟ^改變緩沖液，確定蛋白的展開條件。也可獲取靶標蛋白單獨的活性結構域再使用蛋白質熱轉移法進行相關測試。

5 結 語

本實驗從我校理工結合、教研結合的專業特色出發，以OBE教育理念為導向，從培養目標達成角度分析，將科研中常用的蛋白質熱轉移技術設計導入藥物化學生物學實驗教學環節，把科研成果引進藥學本科課堂教學［18］，通過科研反哺教學。學生通過小組協作自主實驗觀察加入伊維菌素和鹽酸小檗堿兩種不同化合物后，FXR-LBD蛋白的熔解曲線的變化，判斷小分子化合物對蛋白作用的強弱。整個實驗過程既有利于藥學專業本科生理解并掌握小分子與蛋白相互作用的相關藥物化學生物學知識，也有利于同學們了解藥物化學生物學學科的前沿動態，還可激發學生們的學習積極性以及創新精神，培養團隊協作精神，切實為培養具有藥物創新意識、團隊協作精神，能在新藥創制領域從事各類科研開發管理等工作的人才培養目標服務。