維生素K依賴性基質Gla蛋白與慢性腎臟病患者的血管鈣化

劉 煬，向海燕，劉倫志

(湖北民族大學醫學部附屬民大醫院 腎病內科，湖北 恩施 445000)

在慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)患者中，心血管疾病的患病率逐漸上升，并且與其高死亡率直接相關。心血管疾病的風險隨著CKD的進展而逐漸增加。腎小球濾過率每降低10 ml/min，CKD患者發生心血管疾病猝死的風險就增加5%，而且心血管疾病是導致大約50%的終末期腎臟病患者死亡的直接因素[1]。CKD患者所伴隨的這種沉重的心血管疾病負擔不能僅用傳統的危險因素來解釋。例如氧化應激、炎癥和鈣/磷代謝異常等這些新發現的與尿毒癥和透析有關的危險因素，已被證明可促進終末期腎臟病患者發生血管鈣化(vascular calcification，VC)和心血管疾病[2-4]。VC是心血管疾病和尿毒癥患者死亡的獨立危險因素，在CKD早期階段就可出現，并隨著疾病的發展逐漸加重。鈣在人體動脈血管壁內的沉積會導致發生心血管死亡和心血管事件的風險分別增加近4倍和3.4倍[5]。盡管VC在一個多世紀以來都被認為是一種被動性疾病，但近幾年來，VC逐漸被認為是一個涉及調節蛋白和分子的活躍、持續的過程。這些蛋白和分子促進或抑制鈣和羥基磷灰石在血管壁內的沉積。因此，VC應該是其抑制因子和促進因子之間失衡所導致的。在CKD患者中，VC的特征是鈣化抑制因子水平的下降，常表現為血管內膜、中膜和心臟瓣膜的鈣化[6]。腎臟基質Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)的表達隨CKD的進展而逐漸增加，并可以預測腎臟病的預后[7]。

1 腎臟基質Gla蛋白(MGP)

1.1MGP功能的發現 MGP是由軟骨和動脈壁細胞分泌的一種分子量為12 kDa的小蛋白質，包含了84個氨基酸、5個谷氨酸殘基和3個絲氨酸殘基。MGP是第一種在體內外被公認為VC抑制劑的蛋白，也是人體中最有效的天然鈣化抑制劑[8]。此外，這種小蛋白質是唯一已知的不僅可以抑制，而且可以逆轉鈣化的因素。MGP的功能最早是由Luo等[9]發現的，他們使用了MGP基因被敲除的小鼠(MGP-/-)，發現它們出生6～8周后全部死于主動脈鈣化。另有研究發現Keutel綜合征與基因突變所導致的無功能的MGP表達有關。Keutel綜合征是一種常染色體隱性遺傳的罕見病，其特征是軟組織和軟骨過度異位鈣化[10]。這一事實也提示MGP在VC預防中起著關鍵作用。在一項隨訪了7年的118名已確診的糖尿病腎病患者的隊列研究中發現，MGP T-138C(rs1800802)多態性是VC和心血管疾病死亡率的強而獨立的預測因子[11]。Sheng等[12]對23項涉及5 773名對照和5 280例病例的研究進行了薈萃分析，發現MGP G-7A(rs1800801)多態性是血管內膜和中層鈣化的獨立預測因子。這些發現提示VC發病機制和MGP分子活化可能存在遺傳基礎。MGP基因的表達可以通過各種機制進行調節，這些機制有可能成為預測VC進展的基因組生物標志物[13]。

1.2MGP的活化過程和4種亞型 MGP是維生素K依賴蛋白家族的成員之一，該家族是一組涉及凝血、VC和骨代謝的17種人類蛋白[14]。所有維生素K依賴蛋白均具有無活性的谷氨酸殘基，需要維生素K才能使谷氨酸的γ-羧基轉化為γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate，Gla)。維生素K是MGP的羧化過程中的輔助因子，被進一步循環再用于另一次羧化。MGP因為谷氨酸轉化為Gla導致分子結構和形態發生變化而被激活。此外，MGP在羧化之后，還需要進行絲氨酸殘基的磷酸化后才具有生物活性。羧化是維生素K的高度依賴性反應，被認為是MGP激活中最關鍵的步驟。MGP只有在羧化和磷酸化之后，才能獲得與鈣、羥基磷灰石和骨形成蛋白2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)結合的能力，從而抑制VC[15]。因此，MGP由于其經歷不同的轉化方式而以各種形式存在于循環中：完全活化的羧化和磷酸化的MGP，完全未活化的未磷酸化、未羧化的MGP(dp-ucMGP)，部分活化的未磷酸化但羧化的MGP(dp-cMGP)以及部分活化的未羧化但磷酸化的MGP(ucMGP或pucMGP), 如圖1。有學者研究建立了一個健康人群中總MGP的參考區間：6～108 μg/ L，認為較高的總MGP可以確定患有血管疾病的患者。Maastricht的科學團隊是第一個開發出可定量ucMGP總量的特異性抗體的團隊。 Roijers等[16]在尸體解剖過程中收集了12個人體冠狀動脈組織，并利用質子顯微鏡評估了樣本的微鈣化組成狀態。將所有動脈粥樣硬化病變根據微鈣化的嚴重程度分成了4個亞型：Ⅰ型為動脈粥樣硬化前病變，Ⅱ～Ⅳ型為內膜層鈣化范圍逐漸擴大階段。盡管在Ⅰ型病變中未檢測到ucMGP，但在Ⅱ～Ⅳ型中ucMGP染色呈增強趨勢。相反，完全羧化的MGP和BMP-2的染色在Ⅰ型中較弱，而在Ⅳ型病變中則明顯增強。由此可見，羧化的MGP和BMP-2均與微鈣化程度相關，MGP可能通過直接結合BMP-2來充當局部鈣化的抑制因子。此外，MGP的羧化不足伴隨著冠狀動脈的早期亞臨床微鈣化[17]。

1.3dp-ucMG、維生素K和VC Schurgers等[18]通過動物模型發現，維生素K拮抗劑華法林治療6周導致實驗動物體內的MGP羧化不足，從而加快VC。由此可見，MGP需要維生素K才能具有生物活性。為了探討是否可以通過攝入維生素K來逆轉現有的VC，他們將所有大鼠分為低或高劑量的維生素K或華法林組后繼續接受8周的實驗。與補充維生素K的大鼠相比，華法林組的大鼠表現出VC加速，動脈粥樣硬化狀態增強和循環ucMGP水平明顯升高。補充高劑量維生素K導致VC下降了37%。所以，維生素K介導的MGP羧化過程是激活這種強大的VC天然抑制因子的必不可少的步驟。這項研究首次表明補充維生素K可能停止、甚至逆轉VC。盡管在體內、外研究中均取得了初步的結論，但基于人群的研究未能顯示ucMGP與VC和心血管疾病有明確的關聯[19-20]。這可能是由于測量ucMGP的方法對MGP磷酸化狀態不敏感，因為它同時評估了dp-ucMGP和pucMGP。與非磷酸化相比，磷酸化形式的MGP(無論羧化狀態)對結合游離鈣、羥基磷灰石晶體和BMP-2的親和力更高，因此對VC的發展具有不同的影響。另有研究發現絲氨酸殘基的磷酸化是MGP活化的關鍵步驟[21]。特異性夾心抗體的發展使得dp-ucMGP可以與其他MGP形式分開定量，表明循環中的dp-ucMG相比pucMGP是更可靠的維生素K狀態指標、更強的VC標志物和更佳的心血管疾病的預測指標[8，21-22]。

在一般人群中，dp-ucMGP與VC[23-24]、動脈張力[25]和心血管疾病[26]的各種標志物密切相關。類似的結果在以高動脈粥樣硬化狀態為特征的隊列中(如心力衰竭和心血管疾病患者)也有報道[20，27]。由于CKD會使血管內膜和中膜以及軟組織處于加速鈣化的狀態，因此一些研究者探討了這些患者中dp-ucMGP與VC和心血管疾病之間的關系。 Maastricht研究小組對107名不同CKD分期的腎病患者進行了前瞻性研究，發現dp-ucMGP與主動脈鈣化評分、腎功能惡化和全因死亡率密切相關[28]。在67例合并糖尿病的CKD2-5期患者隊列中，dp-ucMGP隨著疾病進展為終末期腎病而逐漸增高，并強烈預測了全因和心血管疾病死亡率[11]。同樣，一些研究者在CKD患者中發現dp-ucMGP與各種VC標記物和腎功能之間關系密切[19，29-30]。在透析患者中，越來越多的證據表明dp-ucMGP水平與心血管疾病死亡率和發病率之間有很強的獨立聯系[31]。Lees 等[32]對27項研究進行薈萃分析后表明，補充維生素K雖然不能降低血管硬度，但是可以顯著改善VC。

2 MGP抑制VC的主要機制

目前MGP抑制VC的機制不完全清楚，主要有以下幾條作用途徑：(1)結合游離鈣離子。由于MGP帶負電，所以它不僅對游離鈣表現出高親和力，還直接與循環中的鈣分子和堆積在血管壁內的羥基磷灰石晶體結合，形成非活性復合物。MGP進一步通過吸引吞噬細胞和巨噬細胞來激活這些復合物的自噬清除[33]。MGP可以將血液循環中的游離鈣清除并引導其進入骨骼內。(2)拮抗骨形態發生蛋白的作用。MGP除了作為鈣螯合劑外，改善VC的另一種分子途徑是下調BMP-2，這是一種眾所周知的VC促進因子。BMP-2可使血管平滑肌細胞轉化為成骨細胞表型。MGP通過抑制BMP-2與其受體的結合來消除BMP-2的表達。Sweatt等[34]在衰老動物模型的動脈粥樣硬化血管中發現了未活化的MGP和游離活化的BMP-2(與其受體結合后)，而在無病變的動脈壁中發現了MGP與BMP-2緊密結合而成的無活性的復合物。Zhang等[35]的研究首次確定了MGP在破骨細胞的分化和功能中起著至關重要的作用，MGP可以抑制破骨細胞的分化和骨吸收。(3)結合平滑肌細胞分泌的基質囊泡。平滑肌細胞具有表型可塑性，其釋放的基質囊泡可以抑制鈣超載導致的平滑肌細胞分泌凋亡小體。MGP可以與平滑肌細胞分泌的基質囊泡結合抑制VC的形成。(4)抗凋亡作用。血管平滑肌細胞中的凋亡小體有利于鈣結晶鹽的沉積，在VC的形成過程中發揮重要重用，MGP的表達會隨著凋亡小體的增長而增高，MGP在體內發揮一定的抗凋亡作用[11]。(5)與細胞外基質成分結合[36]。MGP可以與玻連蛋白和彈力蛋白這兩種細胞外基質成分結合，發揮抑制VC的作用，具體機制目前尚不明確。(6)形成胎球蛋白-MGP-礦化復合物。胎球蛋白和MGP與礦物質核形成穩定的復合物，可以抑制礦物質的增長、聚集和沉積。

3 研究展望

MGP是VC強效抑制劑之一，需要維生素K才能被活化。在CKD和透析患者中，維生素K含量較低的情況已被反復證實。目前尚無關于在CKD和透析患者中補充維生素K的建議。但是，越來越多的證據表明補充維生素K可能會改善VC，以及通過激活MGP延緩心血管疾病的進展。至今還沒有關于維生素K攝入的毒性或嚴重不良反應的報道，因此它被認為是一種安全的療法，具有潛在的重要臨床意義。所以，CKD和透析患者是否需要監測維生素K缺乏癥？如果是，用什么方法？他們應該補充維生素K嗎？目前，一些研究正在調查攝入維生素K是否有抗動脈粥樣硬化作用。這些研究的結果可能會在這一領域有所啟發，可能會建議CKD和透析患者每日適當攝入維生素K。