血清膽紅素水平與2型糖尿病視網膜病變的相關性

佟晶晶，施克新，冷 飛，李鳳萍

(1.錦州醫科大學葫蘆島市中心醫院 研究生培養基地，遼寧 葫蘆島 125000；2.葫蘆島市中心醫院 內分泌科，遼寧 葫蘆島 125000)

糖尿病(DM)是一種以血漿葡萄糖升高為特征的復雜慢性代謝性疾病。中國DM患病率從1980年的0.67%上升至2013年的10.4%，居世界首位[1]。本病與多種并發癥的發生有關，其多重并發癥給患者帶來了巨大負擔。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是DM最具破壞性的微血管并發癥之一，在全球35個研究中心進行的基于流行病學的薈萃分析顯示，DR在DM總人口中的患病率為35.4%[2]，它主要影響工作年齡的成年人，是該年齡段失明的主要原因。

DR是DM終末器官損害的眼部表現，其發病機制比較復雜，主要是由于在遺傳基礎上，長期高血糖導致視網膜多元醇通路活性增加、蛋白激酶C途徑及己糖胺途徑的激活、晚期糖基化終產物(AGEs)的產生以及聚(ADP)-核糖聚合酶上調等，進而導致局部血管的氧化應激(oxidative stress, OS)。OS在DR的發病機理中起著至關重要的作用。OS可引起內皮功能障礙，這是DM微血管并發癥發生和發展最重要的機制。由于部分DR臨床表現不明顯，容易被忽視。因此，早期檢測、早期診斷和早期治療至關重要，以便及時采取干預措施。在臨床上如果能找到簡單有效的風險評估指標，在有高危風險的患者中進行上述眼底篩查，對早期檢測DR將有一定的幫助，并且可以有效減輕患者的痛苦和心理負擔。

膽紅素是血紅素分解代謝的主要產物，是人體內較強的天然抗氧化劑，對微血管具有抗氧化和抗炎作用。膽紅素能夠清除氧自由基、抑制低密度脂蛋白及脂質的過氧化。Jayanthi等[3]發現總膽紅素(TBIL)可作為預測2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)合并有亞臨床甲狀腺疾病患者胰島素抵抗進展的早期生化指標和臨床指標，主要是由于膽紅素的抗氧化特性。此外，膽紅素的測定與其他標記物相比無疑是廉價的，而且是常規檢查項目，臨床醫生很容易獲得。本研究旨在探討血清膽紅素水平對DR的影響，為DR的防治及延緩其進展提供參考及新的理論依據。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年10月至2019年12月在葫蘆島市中心醫院內分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者293例(均符合1999年世界衛生組織(WHO)制定的診斷標準)，男143例，女150例。平均年齡(59.62±10.98)歲，平均病程(13.37±5.02)年。為保障患者的知情同意權，此項研究數據的采用均經過患者本人及家屬同意，所有數據匿名分析，并取得了醫院倫理委員會審核同意。病例排除情況：特殊類型DM患者、1型糖尿病以及合并DM急性并發癥患者；血清膽紅素異常、肝功能異常[ALT和(或)AST>40 U/L]或存在肝膽疾病者及腎功能異常者(肌酐>97 μmol/L)；明顯缺氧、心肺功能不全，處于應激狀態的患者(嚴重創傷、手術、心血管事件等)；急慢性感染者；腫瘤性疾病、營養不良、貧血者；合并自身免疫性疾病及其它系統性、活動性疾病、代謝性疾病患者以及患甲亢、垂體瘤等疾病的患者；近3個月曾服用激素、免疫抑制劑者；口服除降糖以外影響血糖的藥物者；合并有其他眼底病變，或因屈光間質混濁無法看清眼底者；曾行視網膜手術和激光治療者。

1.2研究分組 參照1984年全國眼科學術會議通過的DR的分期標準[4]，Ⅰ期：微血管瘤，小出血點；Ⅱ期：出現硬性滲出；Ⅲ期：出現棉絮狀軟性滲出；Ⅳ期：新生血管形成，玻璃體積血；Ⅴ期：纖維血管增殖、玻璃體機化；Ⅵ期：牽拉性性視網膜脫離、失明。Ⅰ～Ⅲ期為非增生型DR(NPDR)，Ⅳ～Ⅵ期為增生型DR(PDR)。將所有受試對象依據眼科檢查結果分為NDR、NPDR及PDR3組。依據TBIL水平四分位數分組，依據Q1、Q2、Q3和Q4分成4組。

1.3資料收集 符合入選標準的T2DM 患者293例，病案室借閱病例檔案。收集患者資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、病程，體重指數(BMI)(BMI=體重(kg)/身高(cm)2)。

1.4實驗室指標檢測 應用羅氏全自動生化分析儀測定FPG、2 hPG、TBIL、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素( IBIL)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GGT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL-C)及肌酐；應用羅氏全自動免疫分析儀測定空腹C-肽(fasting C-peptide, FCP)、餐后2小時C-肽(C-peptide 2 hours meal, 2 h-CP)；應用愛科來全自動糖化血紅蛋白分析儀測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖；采用重氮法檢測TBIL、DBIL和IBIL；采用酶法檢測ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL、γ-GGT及肌酐；采用高效液相色譜層析法檢測HbA1c；采用電化學發光法檢測C肽。

1.5眼底檢查 所有患者入院后第2天進行系統的眼科檢查，暗室內應用日本KOWA免散瞳眼底照相機進行拍攝55°以黃斑為中心的視網膜彩色圖像，每只眼睛拍攝1張照片，攝片后將彩色圖像傳輸到計算機并打印，眼底攝片不清或肉眼觀病變超過Ⅲ期的患者，由眼科醫師散瞳檢查或行眼底血管熒光造影檢查，之后由有經驗的眼科醫師進行DR篩查和分期。

1.6統計學方法 采用IBM SPSS 24.0進行統計分析。分類變量和連續性變量分別采用頻數/百分比和均數±標準差進行統計描述，分類變量組間比較采用卡方檢驗，滿足正態分布和方差齊性的連續性變量組間比較采用方差分析，偏態分布和方差不齊的連續性資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組間比較分析采用SNK法。采用多元有序Logistic回歸分析DR的危險因素。血清TBIL水平分為四分位數組間比較采用卡方檢驗。TBIL與其他指標的相關性采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1一般臨床資料比較 與NDR組比較，NPDR組和PDR組中的病程、收縮壓均升高(P<0.05)，且PDR組中的病程、收縮壓高于NPDR組(P<0.05)。3組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史及BMI差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2實驗室指標比較 與NDR組比較，NPDR組和PDR組中TBIL、DBIL、2 h-CP均減低，且PDR組中TBIL、DBIL、IBIL、2 h-CP低于NPDR組(P<0.05)。與NDR組比較，PDR組中IBIL低于NDR組(P<0.05)。與NDR組比較，NPDR組和PDR組中FPG、2 hPG、HbA1c、TC均升高(P<0.05)，且PDR組中FPG、2 hPG、HbA1c、γ-GGT高于NPDR組(P<0.05)。與NDR組比較，PDR組中γ-GGT高于NDR組(P<0.05)。FCP、ALT、AST、HDL、LDL、TG及肌酐3組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3DR多元有序Logistic回歸分析 根據單因素分析結果將P<0.05的變量納入有序Logistic回歸模型，結果顯示：TBIL和2 h-CP是DR的保護性因素；病程、SBP、FPG、2 hPG、HbA1c、γ-GGT是DR的危險因素。見表3。

2.4不同總膽紅素水平DR的患病率 依據TBIL水平將所有患者分為4組：Q1組(<7.8 μmol/L)、Q2組(7.8～10.1 μmol/L)、Q3組(10.1～12.65 μmol/L)和Q4組(>12.65 μmol/L)，各組DR患病率分別為68.1%、63.3%、43.1%和26.0%；4組患病率差異有統計學意義(P<0.01)。各組間進行比較，與Q1組相比，Q3組DR的患病率顯著降低(P=0.003)，Q4組患病率亦顯著降低(P<0.01)；與Q2組相比，Q4組的患病率顯著降低(P<0.01)；其余差異無統計學意義。4組DR患病率存在差異，DR的患病率隨著TBIL水平的升高而降低。見表4，圖1。

表1 3組一般臨床資料比較

注：與NDR組比較，*P<0.05，與NPDR 組比較，#P<0.05

表2 3組實驗室指標比較

注：與NDR組比較，*P<0.05，與NPDR比較，#P<0.05

表3 DR多元有序Logistic回歸分析

注：平行性檢驗P=0.07，滿足多元有序logistic回歸假設

表4 不同TBIL四分位數分組DR的患病人數及患病率[例(%)]

注：χ2=32.807，P<0.01。與<7.8比較，*P<0.05；與7.8～10.1比較，#P<0.05

2.5TBIL與各項指標的相關性分析 Spearman相關性分析結果表明：TBIL分別與SBP、FPG、2 hPG、HbA1c呈負相關(P<0.05)，與2 h-CP呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 TBIL與各項指標的相關性分析

圖1 TBIL四分位數分組DR患病率
注：*表示兩組間比較差異有統計學意義

3 討 論

DM是一種影響血糖水平穩態的慢性代謝性疾病，在發展中國家和發達國家都是一個日益嚴重的健康問題[5-6]。DR是DM最常見且嚴重的慢性微血管并發癥之一。世界衛生組織(WHO)宣布DR是第五大失明原因，也是可預防性失明的重要原因之一[7]。在適當管理下，90%以上由DR引起的視力喪失是可以避免的。因此，在臨床實踐中，尋找一種簡便易行的指標來預測DR的發生與發展具有重要的臨床價值。本實驗中的膽紅素指標作為OS的生理性調節因子，近年來，在DM患者中引起廣泛關注。

DR的發生是許多因素共同作用的結果，如上述提到其潛在機制是長期暴露于高血糖和血糖控制不良的狀態下，激活了5個關鍵的生化途徑，導致局部血管的OS并產生活性氧。視網膜微脈管系統受到OS的影響，其附近細胞的選擇性減少而產生微動脈瘤，并且由于內皮素-1合成減少，引起血管眼底膜增厚、微血管內皮細胞血管通透性增加和血管閉塞，導致NPDR的形成；隨著病程進一步加重，誘導內皮細胞和周細胞凋亡以及血管內皮生長因子(VEGF)的產生，VEGF在促進血管生成和血管通透性方面起著關鍵作用，還可介導對血管的有害影響[8]。同時有研究顯示炎癥及血管纖維化也是DR發生發展的關鍵機制[9]，因此VEGF的及其他炎癥和血管纖維化等相關趨化因子過度表達促進了視網膜新生血管形成和血-視網膜屏障完整性的喪失，最終導致PDR，在嚴重情況下會誘發黃斑水腫，甚至失明。

膽紅素是由血紅素加氧酶和膽綠素還原酶對血紅素的順序催化降解而產生的[10]。近年來研究表明，生理水平范圍內的膽紅素水平與DM大血管和微血管并發癥的發生密切相關[11-14]。主要由于生理濃度下高水平的膽紅素具有潛在的抗氧化活性，特別是在疏水性細胞膜中，膽紅素比谷胱甘肽更能保持細胞膜中蛋白質的穩定性[15-16]。研究顯示，在瘦素受體缺乏、飲食誘導的肥胖小鼠中，膽紅素可提高胰島素的敏感性，改善肥胖癥，并可抑制慢性炎癥和內質網應激[17]。膽紅素還通過降低瘦素、血糖和膽固醇濃度，對飲食誘發的肥胖小鼠產生有益作用。從而發揮對DM和代謝綜合征的保護作用[18-19]。此外，血清膽紅素水平與葡萄糖代謝狀態有關，在空腹血糖受損和新發的T2DM患者中，血清膽紅素的水平較高，但隨著DM時間的延長而降低。先前的觀察性研究表明，膽紅素的升高使人類患DM的風險降低26%～31%[20-21]，Abbasi等[22]對3 381例前瞻性隊列參與者進行孟德爾隨機研究，使用位于UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UGT1A1)的rs6742078，發現TBIL升高與DM患病風險存在因果關系，并證明其具有保護性作用。

本研究發現，T2DM患有視網膜病變患者的TBIL、DBIL和IBIL水平顯著低于無視網膜病變的患者，同時PDR患者的TBIL、DBIL和IBIL水平低于NPDR患者的血清膽紅素水平，根據上述所述考慮其原因可能為DM患者長期處于高糖狀態下，氧化應激反應增強，而膽紅素作為抗氧化劑，不斷被消耗，使人體內膽紅素逐漸降低，進而導致DR的發病，以及促進DR的進一步發展。我們進一步行多元有序Logistic回歸分析發現TBIL水平的升高是DR的保護性因素，TBIL每減少1 μmol/L，DR嚴重程度的增加是原來的0.85倍(95%CI0.784-0.921)。這與Karuppannasamy和Ghaffar等[23-24]研究結果相似。本研究又進一步以血清TBIL四分位數進行分組，4組間DR患病率差異有統計學意義，且組間比較提示隨著TBIL濃度的降低，DR的患病率逐漸升高。由此推斷TBIL水平的降低促進了DR的進一步發展，在低血清膽紅素水平的T2DM患者中，應更加關注DR發生的風險。

關于膽紅素對DR的保護機制，可能包括以下幾個方面：①抗氧化：膽紅素比維生素E類似物和谷胱甘肽更能防止低密度脂蛋白及脂質過氧化，與氧化應激標志物呈負相關，與超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶活性呈正相關[25]。因此，較低的血清膽紅素濃度會增加OS，促進DR的發展。②抗炎作用：膽紅素可通過抑制腫瘤壞死因子介導的黏附分子的上調，具有抗炎作用，且膽紅素與C-反應蛋白呈負相關[24]。因此，可以推測血清TBIL水平越高，其抗炎能力越強，越能降低DR發生的風險，延緩其進展。③改善視網膜內皮功能：一項動物研究表明：通過內源性合成或外源性給藥增加血清膽紅素水平，可通過激活蛋白激酶B來改善DM患者視網膜的內皮功能障礙[26]。

此外本研究發現，從T2DM進展到NPDR甚至發展為PDR，2 h-CP的水平逐漸降低，進一步行Logistic回歸分析提示2 h-CP水平的降低是DR的危險因素。表明C肽對T2DM患者視網膜病變的有益影響。Lim等[27]研究表明，C肽通過抑制活性氧的產生、應力纖維的形成、VE-鈣黏蛋白的破壞以及血管通透性的增加，證明了其對VEGF誘導的糖尿病小鼠視網膜微血管滲漏潛在的保護性作用。在相關分析中，我們發現TBIL與2 h-CP存在著正相關的關系?？紤]原因為膽紅素通過其抗氧化作用在β細胞損傷中起到保護作用[28]。

本研究還發現，病程、血糖、HbA1c在NDR、NPDR及PDR 3組之間存在顯著差異，Logistic回歸分析提示病程、血糖、HbA1c是DR的危險因素。同時在相關性分析中，我們發現TBIL與血糖、HbA1c呈負相關。隨著DM病程延長，患者往往伴隨多種并發癥的發生，T2DM并發的慢性眼病在早期DM患者中更為常見，早發作T2DM患者的DR患病率高于晚發者[29]。近年來，高血糖“代謝記憶”成為DM研究領域的熱點問題，患者高血糖時間越長，越容易患微血管疾病，高血糖對微血管的損傷可在降低血糖后持續較長時間[30]。眾所周知，HbA1c是一種可靠的慢性高血糖的標志物，有效的血糖控制與降低HbA1c的水平有關。研究報道HbA1c水平超過7%，反映了長期血糖控制不良，對視網膜微血管的損傷有重要影響[29-31]。HbA1c的形成與OS的增加顯著相關，血清TBIL的升高可通過降低OS而抑制血紅蛋白的糖基化，降低DR發生的風險[23]。

此外，在Logistic回歸分析中我們發現SBP也是DR的危險因素，提示SBP的升高可增加DR的患病風險，有橫斷面研究顯示，由于血壓異?？稍黾友骷羟袘?，破壞DM患者視網膜毛細血管內皮細胞，因此在DM和高血壓患者中，更嚴格的控制血壓可能有助于預防DR的發生[32]。Spearman研究結果顯示TBIL與SBP存在負相關的關系，表明SBP越高，可進一步加重TBIL的缺乏狀態，從而進一步增加DM患者患視網膜病變的風險。在Logistic回歸分析中我們還發現γ-GGT也是DR的危險因素，最近國內外研究報道，γ-GGT直接參與活性氧的形成，被認為是OS的獨立指標，γ-GGT水平的升高增加了糖尿病周圍神經病變和代謝綜合征的發病風險[33-34]。結合本研究結果可推斷，γ-GGT通過參與氧化應激過程促進DR的發生發展。

綜上所述，生理水平范圍內的血清TBIL水平的升高可以有效地延緩或阻斷DR的發生及NPDR進展到PDR的過程，可作為評估DR風險的潛在性生物標志物。2 h-CP水平的降低可能協同參與了DR的發生發展；臨床上當DM患者出現病程、血糖、HbA1c、SBP、γ-GGT的升高，我們應該警惕DR的發生，特別要警惕PDR的發病，提高糖尿病患者生存質量，降低DM患者致殘、致死率。