葵花籽油甘油二酯的制備及其在發酵乳應用中的特性研究

張秀秀，李少華，薛秀恒，孔德瑞

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，合肥 230036)

DAG是油脂的天然成分，含量較低，具有降低餐后血脂水平、抑制體內脂肪積累、緩解糖尿病、抗動脈粥樣硬化、防血栓、抑菌等功能特性。DAG主要存在兩種同分異構體，即1,2-DAG和1,3-DAG，兩者比例為3∶7[1-4]。研究表明，1,3-DAG對抑制體脂積累和防止體重增加具有積極作用[5-8]。近年來關于動物油DAG的研究較多，但動物油DAG含有較多的飽和脂肪酸(SFA)，過多攝入飽和脂肪酸可誘導心血管疾病的發生，對人體健康產生不利影響。因此，開發富含不飽和脂肪酸的植物油DAG用于食品生產十分重要。祝雨筱[9]采用高油酸葵花籽油與無水乙醇在油醇摩爾比1∶50、脂肪酶Lipozyme 435添加量6%(占底物總質量)、反應溫度50℃下反應 1 h，1,2-DAG得率約為88%。DAG獨特的分子結構同時具備較好的親油性和親水性，因此可作為乳化劑[10-12]應用于食品及其他行業中。賀可琳等[13]將鴨油1,3-DAG作為一種食品添加劑加入脫脂奶粉中，發現添加一定量的鴨油1,3-DAG能明顯改善脫脂奶粉的分散性、沖調性和穩定性。

葵花籽油是我國使用最廣泛的植物油之一，與動物油相比含有較多的多不飽和脂肪酸(PUFA)。其中亞油酸被譽為“血管清道夫”，具有保護心血管、降血脂、延緩衰老、提高免疫力、促進骨骼發育和提高記憶力等功能[14-16]。以葵花籽油為原料制備的富含亞油酸DAG不僅可以用于替代乳脂甘油三酯的功能性油脂，也可同時用于肥胖人群及其相關疾病人群的治療。但葵花籽油來源的DAG，由于富含不飽和脂肪酸，其與含飽和脂肪酸含量較高的乳脂DAG相比，質構特性有所不同。因此，利用制得的富含亞油酸DAG開發富含亞油酸DAG的發酵乳制品，并研究其品質特性的變化具有一定的理論與實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葵花籽油(山東魯花集團有限公司)；富含1,3-DAG乳脂(提取自安佳黃油，上海恒天然貿易有限公司)；新西蘭安佳脫脂奶粉(上海恒天然貿易有限公司)；諾維信435脂肪酶(諾維信集團)；SH-486乳酸菌(丹麥科漢森有限公司)；氯化鈉、吐溫-80、氫氧化鈉、氨水、硫酸、乙醚、石油醚，分析純；甲醇、正己烷、異丙醇，色譜純(美國Fisher公司)。

CP244C電子天平，HH-S恒溫水浴鍋，Fluko高速分散器(上海FlukoLU有限公司)，APV 2000超高壓納米均質機(德國APV公司)，Allegra 64R型貝克曼高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)，7890B氣相色譜儀(美國Agilent公司)，Luna silica C18色譜柱(美國Phenomenex公司)，1525系列高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2414示差檢測器(美國Waters公司)，R/S Plus黏度計(美國Brookfield公司)，HR-1旋轉流變儀(美國TA公司)，CT3質構儀(美國Brookfield公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葵花籽油DAG的制備

參照王志耕等[17]的方法并作改進。稱取葵花籽油、甘油、諾維信435脂肪酶于250 mL錐形瓶中，于氣浴恒溫振蕩器53℃、200 r/min條件下振蕩反應一段時間。結束后，將上清液移入離心管中，以5 000 r/min離心5 min。收集上清液在70℃下加熱 10 min 以使殘留的酶失活，得到葵花籽油DAG。DAG含量的測定在實驗室已有的標準曲線基礎上，采用高效液相色譜法測定，具體方法參照文獻[17]。

1.2.2 脂肪酸組成及含量測定

參照GB 5009.168—2016方法對樣品進行前處理。色譜條件：HP-88氣相毛細管柱；氫火焰離子化檢測器溫度280℃；進樣口溫度250℃；分流比100∶1，載氣為氮氣,流量2 mL/min；進樣量1 μL。用相對保留時間定性，用峰面積歸一化法定量。

1.2.3 葵花籽油DAG的酸價、皂化值、碘值的測定

參照GB/T 5530—2005測定酸價，參照GB/T 5534—2008測定皂化值，參照GB/T 5532—2008測定碘值。

1.2.4 DAG部分替代乳脂酸奶的制備

1.2.4.1 酸奶的制備

將脫脂奶粉與蒸餾水以質量比1∶7混合，加入5%白糖，分別加入2%葵花籽油DAG、乳脂DAG和乳脂,用高速分散器分散均勻；再通過超高壓納米均質機將乳液混合均勻，90℃下水浴滅菌20 min；冷卻至42℃以下，接種0.07%的菌粉(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)，密封，42℃發酵4.5 h，然后置于4℃冰箱后熟18 h，得到3組酸奶樣品。

1.2.4.2 酸奶流變特性測定

靜態流變測定[18]：采用黏度計測量，使用具有CC40探頭的同軸圓筒夾具測量25℃下酸奶的流變性質。每組測試均做3次平行。

動態流變測定：采用HR-1旋轉流變儀對酸奶樣品進行測定，使用直徑40 mm圓形平行板，樣品與平行板間隙為1 mm，設置測量溫度25℃，掃描應變0.2%，測定角頻率范圍為0～100 rad/s。

1.2.4.3 酸奶質構特性測定

使用CT3質構儀進行酸奶樣品的凝膠質構的測定。選擇P-36R探針，設置測定條件：測前速度2.0 mm/s，測試速度2.0 mm/s，測后速度2.0 mm/s，壓縮比50%，觸發力5 g。每組測試均做3次平行。

1.2.5 數據分析

本試驗用Microsoft Excel 2013軟件進行數據的錄入和統計，采用SPSS 19統計學軟件進行方差顯著性分析，采用Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 葵花籽油DAG制備單因素試驗

2.1.1 醇油質量比對DAG含量的影響

在酶添加量7%、反應時間12 h條件下，研究醇油質量比(甘油與葵花籽油質量比，下同) 對DAG含量的影響，結果如圖1所示。

圖1 醇油質量比對DAG含量的影響

由圖1可知，醇油質量比達到1∶10時，DAG含量達到最大值，繼續增加葵花籽油量，DAG含量降低，這可能是由于隨著葵花籽油量增加，底物與酶的接觸面積降低。因此，最佳醇油質量比為1∶10。

2.1.2 酶添加量對DAG含量的影響

在醇油質量比1∶10、反應時間12 h條件下，研究酶添加量對DAG含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 酶添加量對DAG含量的影響

由圖2可知，酶添加量在4%～7%之間時，DAG含量隨著酶添加量的增加而逐漸升高，但酶添加量超過7%后，DAG含量呈下降趨勢。原因可能是脂肪酶含量過高時，大部分脂肪酶顆粒會沉積在容器底部，在該反應條件下未能充分分散，導致底物與酶不能充分接觸。因此，最佳酶添加量為7%。

2.1.3 反應時間對DAG含量的影響

在醇油質量比1∶10、酶添加量7%條件下，研究反應時間對DAG含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 反應時間對DAG含量的影響

從圖3可以看出，DAG含量隨著反應時間延長先上升后下降，反應時間為12 h時， DAG含量達到最高值。因此，最佳反應時間為12 h。

2.2 葵花籽油DAG制備的響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果

以醇油質量比(A)、酶添加量(B)、反應時間(C)為自變量，DAG含量(Y)為響應值，設計響應面試驗優化葵花籽油DAG制備工藝。響應面試驗設計及結果如表1所示，方差分析如表2所示。

表1 響應面試驗設計及結果

表2 方差分析

注：**表示影響極顯著(P<0.01)，*表示影響顯著(P<0.05)。

利用Design Expert軟件對表1試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到DAG含量的二次多元回歸方程：Y=48.36+0.37A+1.04B+0.68C-0.068AB+0.14AC-0.12BC-1.24A2-4.16B2-2.05C2。

由表2可知：回歸模型P<0.01，說明回歸模型極顯著；失擬項P=0.105 4>0.05，失擬項不顯著，說明對葵花籽油DAG響應面試驗的擬合情況較好，可以用于葵花籽油DAG制備工藝的優化。對葵花籽油DAG含量的影響由大到小依次為酶添加量(B)>反應時間(C)>醇油質量比(A)。B2、C2對葵花籽油DAG含量影響極顯著(P<0.01)，B、A2、BC對葵花籽油DAG含量的影響顯著(P<0.05)，表明試驗因素對響應值的交互作用關系不是簡單的線性關系。

2.2.2 葵花籽油DAG制備最佳工藝條件的確定及驗證

根據響應面試驗結果，可確定制備葵花籽油DAG的最佳工藝條件為醇油質量比1∶10、酶添加量7.13%、反應時間12.35 h，此時反應產物中DAG含量為49.52%。在最佳工藝條件下進行3次驗證試驗，制得葵花籽油DAG中DAG平均含量為49.21%。實際值與預測值之間無顯著差異(P>0.05)。因此，基于此方法優化的工藝條件準確可靠，有實用價值。

2.3 葵花籽油DAG脂肪酸組成

采用2.2優化制備條件，以乳脂為原料制備乳脂DAG，檢測甘油解反應前后葵花籽油與乳脂中的脂肪酸組成，結果如表3所示。

表3 反應前后葵花籽油和乳脂脂肪酸含量變化 %

由表3可知，乳脂中脂肪酸組成主要為棕櫚酸，約占總脂肪酸的45%，反應后飽和脂肪酸含量無顯著變化，但不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸含量有所下降?？ㄗ延偷膩営退岷扛哌_68.84%，甘油解反應后不飽和脂肪酸含量下降，單不飽和脂肪酸含量升高,可能是酶解促進了亞油酸向油酸的轉化。

2.4 葵花籽油DAG的基本性質(見表4)

表4 葵花籽油DAG的酸價、皂化值和碘值

由表4可知：由于反應過程中產生了副產物游離脂肪酸，使得反應后乳脂DAG和葵花籽油DAG的酸價升高；隨著甘油三酯含量減少，甘油二酯含量明顯增多，并出現甘油一酯，皂化值下降；反應后不飽和脂肪酸含量降低，造成碘值下降，且葵花籽油相較于乳脂的碘值更高，這與植物油的不飽和脂肪酸含量較高有關。

2.5 不同DAG對酸奶流變特性的影響

2.5.1 靜態流變性質(見圖4)

圖4 酸奶樣品的表觀黏度和觸變性

從圖4A可以看出，3組酸奶樣品表觀黏度隨剪切速率增加均呈逐漸下降后趨于平穩趨勢，且均表現出假塑性流體特性。在剪切前期由于剪切應力的增加，發酵乳液在外力作用下分子網狀交聯結構遭到破壞，導致乳液變稀，表觀黏度急劇下降。隨后表觀黏度呈現緩慢下降趨勢，甚至趨于平穩?？ㄗ延虳AG酸奶表觀黏度略高于乳脂DAG酸奶和乳脂酸奶。觸變環是剪切速率由低到高和由高到低的兩個對應過程圖形的上行曲線和下行曲線之間形成的環狀回路，環面積越大，表示該流體觸變性越好[19]，組織黏彈性越好，組織結構更加穩定。從圖4B可以看出，葵花籽油DAG酸奶觸變環面積明顯高于另外兩組，說明葵花籽油DAG酸奶具有較好的觸變性，凝膠結構更加穩定?？赡茉蚴强ㄗ延虳AG酸奶中不飽和脂肪酸的存在促進了脂肪球膜與酪蛋白之間相互作用，使網絡結構更加緊密。

2.5.2 動態流變性質(見圖5、圖6)

圖5 動態模量隨角頻率變化曲線

圖6 tanδ隨角頻率變化曲線

儲能模量(G′)和損耗模量(G″)在一定程度上分別對應體系的彈性和黏性，G′較高時，體系彈性較大，G″較高時，體系黏性較好。由圖5可以看出，酸奶體系的G′和G″均隨角頻率的增加而呈現逐漸增加的趨勢，說明增加外在作用力，體系形變越大，而恢復形變所需能量將增大，表現出明顯的黏彈性?？ㄗ延虳AG酸奶和乳脂DAG酸奶體系的G′與G″較乳脂酸奶高，說明植物油DAG和乳脂DAG的添加會增加酸奶體系的黏彈性特征?？ㄗ延虳AG酸奶的動態模量始終高于乳脂DAG酸奶，這與植物油中的脂肪顆粒較動物油更易與酪蛋白粒子之間發生交聯有關，動態流變測定結果與靜態流變結果一致。

從圖6可以看出，酸奶體系的損耗因子(tanδ)均小于1，說明其彈性性能始終略高于黏性性能，這表現為一種弱凝膠動態流變學特征。乳脂DAG酸奶tanδ較大，其乳液體系更趨向于固態，流動性低?？ㄗ延虳AG酸奶tanδ一直處于較低狀態，說明葵花籽油DAG酸奶體系表現出較好的流動性，相對于乳脂DAG酸奶黏性更大。

2.5.3 酸奶質構測定結果(見表5)

表5 酸奶樣品的質構指標測定結果

由表5可知，3組酸奶樣品的堅實度、稠度、黏度等受到油脂類型的影響，且與上述油脂的不飽和脂肪酸含量呈正相關，葵花籽油DAG酸奶的堅實度和稠度最高，說明其發酵過程中蛋白質的交聯程度高。黏度由高到低依次為葵花籽油DAG酸奶>乳脂DAG酸奶>乳脂酸奶，與流變測定結果一致。

3 結 論

研究表明，獲得葵花籽油DAG最佳酶解制備工藝條件為：甘油與葵花籽油質量比1∶10，酶添加量7.13%，反應時間12.35 h。在最佳條件下，酶解反應制備葵花籽油DAG中DAG含量可達49.21%，亞油酸含量為60.17%?？ㄗ延虳AG替代乳脂可增加酸奶的不飽和脂肪酸含量，改善酸奶的黏彈性和質構特性，為其在食品中的應用及新型酸奶產品的開發提供了一定的理論基礎。