添加黃芪超細粉和抗生素對瘤胃體外發酵的影響

魏海燕，王憲舉，閆 琦，姜翠霞，丁路明，2*，趙索南

(1. 蘭州大學 草地農業生態系統國家重點實驗室/生命科學學院，蘭州 730000；2. 青海大學 青海省高寒草地適應性管理重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省海北州畜牧獸醫科學研究所，青海 西海 810299)

近年來通過營養調控措施達到增強動物的免疫機能和抗病能力，緩解應激引起的生產性能下降，已經成為畜牧業亟需解決的問題[1]。植物活性多糖具有調節機體免疫功能、抗菌、抗病毒及抗炎等活性作用[2]。中草藥作為動物飼喂的添加劑既有營養作用，也有藥用作用，可以提高動物生長性能也能保護動物健康[3]。其主要機理是調動機體的免疫功能和對全身性治療的抗病能力[4]。黃芪含有多糖、黃酮、氨基酸及微量元素和皂苷類等具有抗腫瘤作用的營養成分[5]。黃芪作為臨床所用的一種補益中藥，具有利水退腫、補脾益氣和固表止汗的功能，是一種臨床用于治療肝癌的中藥之一[6]。反芻動物被飼喂抗生素以保持瘤胃發酵平衡，但飼喂抗生素存在著動物機體內的殘余問題以及耐藥性的問題[7],越來越多的植物源添加被用于動物飼料的研究。本試驗通過分別在模擬瘤胃體外發酵中添加黃芪和四環素，研究對體外干物質消化率、瘤胃發酵參數以及瘤胃微生物的影響，為黃芪作為中藥飼料添加劑用于反芻動物飼喂提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理

苜蓿和黃芪采自甘肅省隴西縣；四環素(注射用鹽酸四環素)購買于北京賽孚制藥有限公司。本試驗以苜蓿干草粉作為培養底物，苜蓿經過65℃烘干后粉碎過1 mm網篩備用。黃芪經過65 ℃烘干后，進行切段處理，磨成超細粉(200目)。苜蓿與黃芪的營養成分見表1。

1.2 瘤胃液采集與處理

試驗選取6頭健康的、年齡相近、體重為200±10 kg的牦牛，自由采食，其日糧組分見表2。于08:00晨飼前使用自制瘤胃軟導管分別采集6頭牦牛

表1 底物和添加劑的營養水平(干物質基礎)

表2 試驗動物飼糧組成及營養水平(干物質水平)

瘤胃液300 mL/頭，經4層紗布過濾后一部分分裝入3個10 mL離心管中投入液氮罐帶回實驗室低溫儲存；一部分過濾到39 ℃預熱的保溫瓶中，并混合均勻，迅速運回實驗室。

1.3 試驗設計

準確稱取苜蓿干草粉0.5 g (W1)于濾袋中，并記錄總重(W2)。試驗設置三個處理：在發酵液中以空白、添加黃芪超細粉、添加抗生素作為三個處理。其中黃芪粉和四環素的添加量為苜蓿草粉的5%DM。每個處理三個重復。以 Daisy II 培養箱 Daisy PII P Incubator體外模擬培養箱的要求進行緩沖溶液的配制，稱取苜蓿干草粉的濾袋封口后放置于Daisy II培養箱消化罐中 (每個罐放置25個樣品)。將盛有樣品和緩沖溶液的消化罐放置于Daisy II培養箱中，允許消化罐的溫度在20～30 min達到平衡。分別加入400 mL混合均勻的瘤胃液在緩沖溶液和樣品中。分別在體外發酵12 h、24 h和48h進行發酵液和濾袋的收集，進行后續分析。

1.4 樣品分析與檢測

1.4.1 試驗材料的化學成分分析 干物質含量采用烘干法進行測定[8]；粗灰分測定參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》(第三版)[9]；粗蛋白質采用凱氏定氮儀(JK-9830，中國)進行測定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用ANKOM 2000i全自動纖維分析儀進行測定；粗脂肪用乙醚浸提法進行分析[10]。

1.4.2 體外干物質降解率 分別取12、24、48 h體外發酵后的濾袋，在25～39 ℃的溫水中洗滌尼龍袋，用玻璃棒不斷攪拌,不斷換水直至洗滌用水無色為止,在65 ℃烘箱中烘48 h后，回潮稱重。

體外干物質降解率(V)： = (W2-W3) / W1

式中：W1:苜蓿干草粉重(g);W2:苜蓿干草粉和濾袋的總重(g):W3:體外發酵后苜蓿干草粉和濾袋的總重(g)。

1.5 瘤胃液發酵參數

1.5.1 瘤胃液pH和揮發性脂肪酸(VFA) 從Daisy II培養箱取下消化罐，立即進行pH的測定(雷磁PHS-29A)。瘤胃液于4 ℃冰箱解凍，漩渦混勻，取上清液于10 mL離心管中進行離心(2 000 g，10 min),取上清液1 mL置于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL去蛋白溶液，混勻，冰水浴中靜置30 min，4 ℃下離心(10 000 g,10 min)，冰水浴儲藏待用。使用微量進樣器進樣，氣象色譜儀(AP-3201A)對瘤胃VFA進行分離，后續試驗步驟及氣相色譜條件參考周建偉[11]的方法。

1.5.2 瘤胃液氨態氮NH3-N 取瘤胃液4 mL放入4 ℃ 冰箱中解凍，加入0.3 mL65%(wt/vol)的三氯乙酸，搖勻，之后將樣品放置在冰盒里30 min，隨后將樣品在4 ℃、28 000 g的條件下離心15 min，取上清液用U-2900分光光度計在630 nm波長下測定NH3-N濃度。

1.6 瘤胃微生物的多樣性

將瘤胃液原液以及發酵過的瘤胃液送于北京百邁克生物科技有限公司進行微生物檢測，主要操作步驟包括：首先對DNA樣品進行提取、PCR擴增和純化；得到優化序列；將優化序列進行聚類，劃分OTU，并根據OTU的序列組成得到其物種分類；通過Alpha多樣性分析研究單個樣品內部的物種多樣性，統計了各樣品在97%相似度水平下的Chao和Shannon指數。

1.7 數據分析與處理

在Excel中作數據的基本處理，應用SPSS 20.0進行ANOVA方差分析和LSD多重比較，數據表示為平均值，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 黃芪粉對模擬瘤胃體外發酵消化率的影響

由表3知，在發酵過程中，對照組和黃芪組的消化率極顯著升高，而四環素組差異不顯著。在12、24、48 h各個時間點，黃芪組顯著高于其他兩組，且在24和48 h對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。

2.2 黃芪粉對模擬瘤胃體外發酵指標的影響

如表4所示，每個處理組隨著發酵時間延長pH均下降，其中12～24 h顯著下降。在各個發酵時間點，四環素發酵組的pH均顯著高于其他兩組(P<0.05)。隨著發酵時間延續，對照組和四環素組的NH3-N極顯著上升(P<0.01)；而黃芪組顯著下降(P<0.05)。隨著發酵時間延續，對照組和黃芪添加組總揮發性脂肪酸(TVFA)均極顯著上升(P<0.01)，而四環素組顯著下降(P<0.05)；在體外發酵的各個時間點，黃芪組TVFA顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。隨著發酵時間延續，對照組和四環素組乙酸和丙酸在24～48 h極顯著下降(P<0.01)，而黃芪組顯著上升(P<0.05)。隨著發酵時間延續，各處理組乙酸/丙酸含量顯著下降(P<0.05)；在12和24 h，對照組和黃芪組顯著高于四環素組，而對照組和四環素組差異不顯著；在48 h，黃芪組顯著高于其他兩組，對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。

表3 添加黃芪粉和抗生素在不同模擬瘤胃體外發酵時間的干物質降解率/%

注：同行數據肩標不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letter superscripts in the same row mean significant difference(P<0.05)，different capital letter superscritps in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表4 添加黃芪粉和抗生素對模擬瘤胃體外發酵液指標的影響

2.3 瘤胃微生物

2.3.1 黃芪粉對體外發酵瘤胃微生物多樣性的影響 由表5可得，隨著發酵時間延續，對照組和四環素組隨著發酵時間延續OTU數顯著降低，而黃芪組顯著升高；在發酵12 h，對照組和四環素組顯著高于黃芪組；在發酵24和48 h，黃芪組顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。黃芪組隨著發酵時間延續，Chao指數12～48 h呈現出“U”形的變化趨勢；香農指數顯著上升(P<0.05)。對照組和四環素組隨著發酵時間延續，Chao指數極顯著降低(P<0.01)；香農指數在12～24 h顯著降低(P<0.05)。在發酵12 h，對照組和黃芪組的Chao指數顯著高于四環素組，對照組和四環素的香農指數組顯著高于黃芪組；在發酵24和48 h，黃芪組的Chao指數和香農指數顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。

表5 添加黃芪粉和抗生素對瘤胃微生物OTU數和Alpha多樣性的影響

2.3.2 黃芪粉對模擬瘤胃體外發酵瘤胃門水平微生物群落結構的影響 由圖1(左)可見，在門水平上，各組體外發酵液中的優勢菌群均為擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。由表6可得，擬桿菌(Bacteroidetes)在發酵各個時間點黃芪組顯著高于其他兩組。厚壁菌門(Firmicutes)在發酵過程中，對照組和黃芪組顯著升高，而四環素組顯著下降。變形菌門(Protecbacteria)在發酵過程中對照組極顯著下降(P<0.01)，且在發酵的各個時間點，四環素組顯著高于其他兩組(P<0.05)，且對照組顯著高于四環素組(P<0.05)。

2.3.3 黃芪粉對體外發酵瘤胃屬水平的微生物群落結構的影響 由圖1(右)可得，在屬水平上，對照組和黃芪組體外發酵液的優勢菌群為普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)、腸桿菌屬(Enterobacter)和理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)，四環素組體外發酵液的優勢菌群為腸桿菌屬(Enterobacter)和埃研氏志賀氏菌(Escherichia-Shigella)。對照組的普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)在發酵24 h顯著升高，而黃芪組在發酵過程中顯著降低。對照組的腸桿菌屬(Enterobacter)在發酵過程中顯著降低，而四環素組在發酵24 h顯著升高(P<0.05)。對照組和黃芪組的理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)在24 h顯著降低(P<0.05)，而四環素在發酵過程中極顯著降低(P<0.01)。四環素組的埃研氏志賀氏菌(Escherichia-Shigella)在發酵過程中極顯著升高(P<0.01)。

圖1 瘤胃微生物在門(左)和屬(右)水平上的相對豐度

表6 添加黃芪粉和抗生素對于優勢瘤胃細菌相對豐度的影響(門水平)

3 討 論

3.1 黃芪粉對模擬瘤胃體外干物質降解率的影響

飼料降解率是對飼料利用效率的一個重要衡量，Deng等[12]在用體外發酵法研究不同濃度的黃芪根部提取物對體外干物質降解率的影響研究中發現，黃芪根部提取物的添加，使得體外發酵的干物質降解率顯著升高。在本試驗中，黃芪組的體外消化率在各個時間段均高于對照組和四環素組，本試驗與其研究結果一致，其原因可能是黃芪作為一種中草藥所含的活性物質有利于飼料的降解。

3.2 不同處理對瘤胃體外發酵指標的影響

正常的反芻動物瘤胃液pH維持在6～7之間，本試驗中pH的變化范圍在6.33～6.61之間，屬于正常范圍，說明黃芪和四環素的添加未對瘤胃發酵產生不良的影響，隨著發酵時間延續，瘤胃液pH處于下降趨勢。這是由于在體外發酵中，持續產生的VFA會在發酵罐中積累，所以使得在試驗結束時pH降低[13]。

瘤胃液NH3-N是對瘤胃液氮代謝的重要衡量標準，其濃度高低可反應飼料蛋白的降解和微生物蛋白的合成情況[14]。本試驗中，對照組和四環素組NH3-N隨著發酵時間的延續逐漸升高，但黃芪組逐漸降低，黃芪組比其他兩組多添加了黃芪，隨著發酵，微生物蛋白含量升高，使得黃芪組的NH3-N在12 h高于其他組，且隨著發酵NH3-N濃度降低，這就說明黃芪組的微生物蛋白合成速度大于飼料蛋白降解的速度。但四環素組NH3-N含量逐漸升高，可能表示著四環素組微生物蛋白合成速度大于對照組，也可能是由于四環素組抑制了飼料蛋白的降解。

表7 隨著體外發酵時間的延續添加黃芪粉和抗生素在屬水平上優勢瘤胃微生物數量的變化

瘤胃液中的VFA是有機體在發酵過程中的重要產物，為反芻動物維持正常的新陳代謝提供了能源物質[15]。隨著發酵時間延續，對照組和黃芪組的TVFA顯著升高，而四環素組差異不顯著，但呈上升趨勢。且在各個時間點黃芪組高于對照組，說明黃芪組的發酵罐中最為活躍，能為反芻動物育肥提供豐富的脂肪合成底物。本試驗對照組和黃芪組其中12～24 h增長比24～48 h增長快，這與瘤胃微生物活性有關，微生物在指數型生長之后，生長速度趨于平緩，然后進入衰退期[16]。本試驗結果說明，黃芪組在體外發酵中產生了正組合效應，有利于微生物對飼料的降解[15]，且分解速度快，發酵迅速，使得乙酸和丙酸含量提高。有研究表明，在VFA中丙酸含量上升，說明瘤胃在消化后能量的利用率提高，黃芪組的乙酸/丙酸大于3，此組的發酵模式屬于乙酸型[15]。因此黃芪組更有利于VFA的生成。

3.3 瘤胃微生物

瘤胃微生物通過一系列復雜的生化反應，把飼料所含有的營養物質轉化為揮發性脂肪酸以及微生物蛋白，從而為反芻動物提供能源[17]。微生物的多樣性研究主要基于編碼核糖體RNA核酸序列保守區進行的[18]。細菌主要基于16S區。OTU是認為設計的一個分類單元，其中每一個OTU代表一種序列。Chao指數是衡量物種豐富度即物種數量的多少；Shannon指數用于衡量物種多樣性[19]。在本試驗中，隨著發酵時間延續，黃芪組OTU數顯著增高，而對照組和四環素組顯著降低，且黃芪組的OTU數顯著高于其他兩組。隨著發酵時間延續，對照組和四環素組的Chao指數和Shannon指數顯著降低，且黃芪組的Chao指數顯著高于對照組和四環素組；黃芪組的Shannon指數顯著高于其他兩組。說明黃芪的添加顯著提高了瘤胃細菌的多樣性，而四環素組顯著抑制了瘤胃細菌的生長與繁殖。

在瘤胃細菌群落中，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是3大優勢菌群[20]。李燁青等[16]基于16S-rRNA分析了奶牛體外發酵瘤胃微生物區系變化的研究表明擬桿菌的相對豐度會在12 h后降低，而厚壁菌在12 h時升高，這與本試驗的黃芪組的研究結果一致。本試驗中，黃芪組的擬桿菌門顯著降低、厚壁菌門顯著升高，而對照組組兩者都降低，四環素組兩者都升高，說明黃芪的添加有助于牦牛對于能量的攝取、轉化和儲存，而四環素組抑制了厚壁菌的生長。很大一部分變形菌門的菌屬可以與其它菌屬競爭生存，同時也能在低碳條件下適度生存[21]，所以隨著發酵時間的延續，蛋白質和淀粉等物質基本被降解，變形菌的相對豐度也會相對增加，這與本試驗的四環素組的研究結果是一致的。普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，其可以在瘤胃內降解并利用淀粉和植物細胞壁多糖，但是不可以降解纖維素[22]。Li[23]認為普雷沃氏菌屬在降解纖維方面發揮著潛在作用，其會受到活性比較高的纖維分解菌的抑制，這也就意味著普雷沃氏菌屬的相對豐度隨著發酵時間延續而先升高后降低。而在本試驗中，CK組與這個研究結果一致，而黃芪組和四環素組顯著降低，且四環素組在各個體外發酵時間段低于其他兩組，這可能是由于四環素組抑制了普雷沃氏菌。

腸桿菌屬主要用于發酵葡萄糖。在本試驗中對照組的該菌屬顯著降低，而黃芪組的該菌屬含量很少，而四環素組其菌屬顯著升高，說明黃芪的添加抑制了該菌的生長，而四環素組卻與黃芪組相反。說明四環素的添加可能有利于該菌屬的生長。Rikenellaceae_RC9_gut_group屬于理研菌科，主要作用是碳水化合物和蛋白質的發酵[24]。在本試驗中對照組其先下降后上升，黃芪組先下降后趨于平穩，而四環素組顯著下降。說明四環素的添加顯著降低Rikenellaceae_RC9_gut_group的活性。埃希氏志賀氏菌屬于變形菌門屬，對照組和黃芪組的埃希氏志賀氏菌相對豐度很少；但四環素組隨著發酵時間延續，到24 h其相對豐度顯著升高，并且與變形菌的變化趨勢相一致，說明在變形菌門中埃希氏志賀氏菌起著很大的作用。

4 結 論

(1)在瘤胃體外發酵液中添加黃芪超細粉，提高了體外干物質降解率；(2)在瘤胃體外發酵液中添加黃芪超細粉，增加了總揮發性脂肪酸濃度、乙酸與丙酸的比；(3)在瘤胃體外發酵液中添加黃芪超細粉，提高了微生物的相對豐度和多樣性，在門水平上優勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門；屬水平上的優勢菌群為普雷沃氏菌屬和Rikenellaceae_RC9_gut_group。且黃芪超細粉的添加提高了發酵罐中厚壁菌門的豐度，降低了擬桿菌門的豐度。