慢病毒載體介導的Nrf2表達下調對肝星狀細胞生物學行為的影響

蔡陳效 鉏莉 王曉晗

[摘要] 目的 觀察重組慢病毒載體介導Nrf2表達下調對肝星狀細胞生物學行為的影響，同時探討其可能的作用機制。 方法 利用重組DNA技術將特異性shRNA序列插入慢病毒表達載體pGLV3.GFP中，形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA，將其轉染至293T細胞中，隨后進行病毒包裝、滴度測定、轉染率計算。采用實時熒光定量、Western blot測定轉染肝星狀細胞株（HSC-T6細胞）Nrt2 mRNA及蛋白的表達情況，利用Tunel染色法檢測HSC-T6細胞的凋亡情況，同時對HSC-T6細胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平進行測定。 結果 構建的重組病毒載體 LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T細胞。激光共聚焦顯示空白組細胞凋亡率低于A組和B組，與A組比較，B組的細胞凋亡率降低（P<0.05）。實時熒光定量PCR法結果顯示空白組Nrf2 mRNA水平高于A組和B組（P<0.05），與A組比較，B組mRNA水平升高（P<0.05）。Western blot法顯示空白組Nrf2蛋白水平高于A組和B組（P<0.05），與A組比較，B組蛋白水平升高（P<0.05）。與空白組相比，A組和B組PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表達量增加（P<0.05），Bax蛋白減少（P<0.05），其中A組PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平較B組增加（P<0.05），Bax蛋白水平低于B組（P<0.05）。 結論 Nrf2基因的shRNA慢病毒載體pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在體外可抑制肝星狀細胞活化，其作用機制可能與通過抑制PI3K-Akt通路促肝星狀細胞凋亡有關。

[關鍵詞] 慢病毒載體;HSC-T6細胞;Nrf2;PI3K-Akt通路;凋亡

[中圖分類號] R575.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）13-0015-04

[Abstract] Objective To observe the influence of down-regulated expression of Nrf2 mediated by recombinant lentiviral vectors on biological behaviors of hepatic stellate cells， and to explore the likely mechanism. Methods The specific shRNA sequence was inserted into the lentiviral vector pGLV3.GFP by the recombinant DNA technique to form pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA， which was transfected to 293T cells. Then， virus packaging， titre determination and calculation of transfection efficiency were performed. The expression of Nrt2 mRNA and protein in transfected hepatic stellate cells（HSC-T6 cells） was determined by real time quantitative PCR and Western blot， the apoptosis of HSC-T6 cells was detected by the Tunel staining method， and the protein levels of PI3K， Akt， p-Akt， p-Bad， Bcl-2 and Bax in HSC-T6 cells were determined at the same time. Results The constructed recombinant virus vector LV3-H1-GFP-shRNA Can effectively infect 293T cells. It was found by laser confocal scanning that the apoptosis rate was lower in the blank group than in group A and group B， and the apoptosis rate was lower in group B than in group A（P<0.05）. It was found by real time quantitative PCR that the Nrf2 mRNA level was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the Nrf2 mRNA level was higher in group B than in group A（P<0.05）. It was found by Western blot that the Nrf2 protein level was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the Nrf2 protein level was higher in group B than in group A（P<0.05）. The protein levels of PI3K， p-Akt， p-Bad， and Bcl-2 were lower in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the protein level of Bax was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）. The protein expression of PI3K， p-Akt， p-Bad， and Bcl-2 were higher in group A than in group B（P<0.05）， and the protein expression of Bax was lower in group A than in group B（P<0.05）. Conclusion The shRNA lentiviral vector pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA of Nrf2 gene can inhibit the activation of hepatic stellate cells in vitro， and its mechanism may be related with promoting apoptosis of hepatic stellate cells by inhibiting the PI3K-Akt pathway.

[Key words] Lentiviral vector; HSC-T6 cell; Nrf2; PI3K-AKT pathway; Apoptosis

細胞外基質的過度沉積導致肝纖維化的出現，有研究[1，2]顯示肝星狀細胞（Hepatic stellatecells，HSCs）的激活是導致肝纖維化的重要環節，任何因素導致HSCs的生物行為學改變均可導致肝纖維化的發生發展。因此可以推測，各種干預措施（藥物、各種刺激等）如果能夠抑制HSCs的生物行為及功能，就可在一定程度上減輕甚至逆轉肝纖維化。有研究[3]顯示抑制轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）的表達可抑制HSC活化，從而減輕肝纖維化程度，但其是通過何種途徑實現目前尚不可知?；谏鲜霰尘凹把芯炕A，本實驗構建針對大鼠Nrf2基因的慢病毒載體，進一步研究Nrf2影響HSCs的生物行為的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

DMEM培養基、胰蛋白酶及優質胎牛血清（Gibco公司）;人肝星狀細胞HSC-T6（中南大學湘雅醫院細胞中心），Liprofectamine2000（美國Invitrogen公司），Annexin-FITC/PI細胞檢測試劑盒（Invitrogen公司），PVDF膜（美國Millipore公司），二甲基亞砜（DMSO）（廈門鷺隆生物科技發展有限公司），細胞恒溫培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司），流式細胞儀（美國BD公司），倒置相差熒光顯微鏡（美國OLYMPUS公司），酶標自動分析儀（美國BIO-BAD公司）。

1.2 細胞培養方法

將HSC-T6復蘇后常規置于DMEM高糖培養基中（10% 胎牛血清+1%卡那霉素和新霉素）培養，培養環境模擬細胞生物體內環境，條件如下：穩定的溫度（37°C）、穩定的CO2水平（5%）、恒定的酸堿度（pH值：7.2～7.4）、較高的相對飽和濕度（95%），2 d換液1次，待細胞生長至80%左右，用胰酶消化，傳代培養。將狀態良好的目的細胞以5×104/mL密度接種于24孔板中，接種細胞數量因細胞生長速度略有不同，一般是保證次日進行病毒感染時細胞的匯合率在80%～90%。

1.3 慢病毒載體構建

此過程由中國豐暉生物技術有限公司完成，參照GenBank將大鼠Nfe2l2基因（NM 031789.2）的cDNA作為目標模板，遵循化學合成siRNA設計原則，選擇RNAi靶序列，在完成Blast基因組同源性分析后合成相應的shRNA表達質粒，隨后對慢病毒載體進行測序鑒定證明載體構建成功，隨之進行慢病毒載體包裝及測定滴度。

1.4 重組病毒感染靶細胞

將293T細胞置于培養瓶中培養至細胞的匯合率在80%～90%時摒棄細胞原有的培養基，隨后加入2 mL滅菌的D-Hanks溶液洗滌細胞生長面，然后棄去該溶液，加入1 mL胰酶消化液，充分混勻后將混合液置于37℃消化約3～5 min，加入2 mL含10%FBS的DMEM培養液，用刻度吸管吹打數次后形成單細胞懸液，隨后將細胞稀釋至密度為3×105/mL后接種于96孔板中，充分混勻后在模擬細胞生物體內環境下（37℃、5%CO2、飽和濕度）培養24 h，仔細吸取96孔板中舊的培養基，每孔加入重組慢病毒（A組）和空載病毒（B組）5×107TU，設立未添加病毒的空白細胞對照組，每孔中加入終濃度為5 μg/mL的Polybrene，將細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度中轉染12 h，PBS沖洗換液，加入150 μL 10%FBS的DMEM培養液，37℃、5%CO2、飽和濕度環境中繼續培養48 h。利用熒光顯微鏡觀察各組細胞的Nrf2表達水平變化及轉染率的差異。

1.5 實時熒光定量PCR檢測靶細胞中Nrf2 mRNA的表達

將細胞加入Trizol 提取液提取細胞總RNA，用TaKaRa逆轉錄酶進行逆轉錄合成cDNA。根據NCBI中Genebank基因庫的設計引物序列得出：Mfn2的上游引物序列為5'-GATGACAGAG-GAAGTGGAAAGGC-3'，下游引物序列為5'-ACAGACACAGGAAGA-AGGGGCT-3';反應體系為 20 μL，逆轉錄過程 ：95℃（3 min）→95℃變性（20 s）→55℃退火（30 s）→72℃延伸（3 min），30個循環。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用GAPDH作為內部參照，將GAPDH的拷貝數作為校正基數，GAPDH的上游引物序列為5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物序列為5'-TTTGAG-GGTGCAGCGAACTT-3'。通過ABI7500軟件獲得檢測指標Ct（cycle threshold）值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應指標的ΔCt值。以空白組ΔCt值作為校正，軟件根據2-ΔΔCt數值計算得出檢測指標基因濃度水平。

1.6 Western blot檢測靶細胞中Nrf2、PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白的表達

提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結束后將凝膠取出，進行轉膜，遵循膠在負極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時間依據各指標分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行預染，看電泳帶是否清晰，證實蛋白質確實轉移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入抗Nrf2、PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax及β-actin一抗抗體孵育，4℃過夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記與一抗相抗的二抗IgG（1：2000）室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放人配好的顯色液中反應1 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.7 Tunel染色

采用Tunel試劑盒對各組生長處于對數的HSC-T6細胞凋亡情況進行檢測，經DAPI染色后細胞核及凋亡神經元細胞分別呈現藍色熒光及綠色熒光，采用激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察，每個腦片隨機選取5個視野，采用Image.ProPlus圖像分析處理系統軟件進行凋亡細胞數的計算。凋亡細胞率=（綠色熒光的凋亡細胞數/DAPI染色的總細胞數）×100%。

1.8 統計學方法

應用SPSS20.0統計學軟件對結果進行處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，計量資料兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用One-Way ANOVA單因素方差分析，Western Blott及Tunel染色圖片利用oringe軟件及Image J軟件進行作圖及圖片處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒感染靶細胞情況及轉染效率評估

結果顯示利用慢病毒載體成功感染了293T細胞，利用熒光顯微鏡觀察各組293T細胞，結果證實構建的重組病毒載體LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T細胞。經預實驗，篩選出最適MOI為10，轉染效率達75%。見封三圖1。

2.2 各組HSC-T6細胞中Nrf2 mRNA的表達變化

利用實時熒光定量PCR法對HSC-T6細胞中Nrf2 mRNA表達進行測定，將空白組細胞的Nrf2 mRNA設置為1，結果顯示LV3-H1-GFP-shRNA后A組細胞Nrf2 mRNA相對水平為（0.28±0.06），B組Nrf2 mRNA相對水平為（0.59±0.17），差異有統計學意義（t=4.39，P=0.01<0.05）。

2.3 各組HSC-T6細胞中Nrf2蛋白的表達變化

利用Western blot法對HSC-T6細胞中Nrf2蛋白表達進行測定，結果顯示LV3-H1-GFP-shRNA后細胞Nrf2蛋白下降，A組Nrf2/β-actin比值為（0.32±0.01），B組Nrf2/β-actin比值為（0.71±0.02），空白組Nrf2/β-actin比值為（1.15±0.04），差異有統計學意義（t=4.32，P=0.01<0.05）。見圖1、2。

2.4 各組HSC-T6細胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax表達情況

采用Western blot對各組HSC-T6細胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平進行測定。與其他兩組相比，A組PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白表達量增加，Bax蛋白減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3、4及表1。

2.5 各組HSC-T6細胞凋亡情況

經過激光共聚焦觀察可知，空白組幾乎未見綠色熒光，細胞凋亡率為（0.51±0.14）%，慢性病毒載體轉染的細胞被綠色熒光標記的細胞均較空白組多，A組細胞凋亡率為（2.15±0.17）%，B組細胞凋亡率為（1.63±0.31）%，三組差異有統計學意義（F=6.41，P=0.00<0.05），A組綠色熒光標記的細胞數目較B組多。見封三圖2。

3 討論

細胞脂滴在肝臟受到內源性或外源性刺激時消失，處于靜態的HSCs可轉變為肌成纖維樣細胞，這一過程亦稱之為“活化”[4]，HSCs生物學行為表現是影響肝纖維化進程的核心環節[5]，如若治療不及時或不恰當，肝纖維化則可進一步發展成肝硬化甚至肝癌[6]。近年來不少研究[7-9]證實肝纖維化程度的減弱與HSC活化程度減少有關，而HSCs表型的轉化并非HSCs活化的關鍵，凋亡才是影響HSCs活化的中心環節。HSCs凋亡不破壞HSCs細胞器的結構完整性，亦不會影響HSCs微環境，僅削減HSCs的活化細胞數量。Nrf2是CNC 轉率因子家族的重要因子之一，大量分布于組織器官中，對其發揮保護效應[10]。當機體接受氧化應激信號時，Nrf2會產生核移位進入細胞核內結合ARE，隨之激活其下游的大量活性因子，從而調節細胞的氧化還原狀態，實現抵御氧化應激損傷。有數據[11-13]顯示，當肝星狀細胞處于氧化應激環境中時可被活化，而Nrf2是肝星狀細胞中與氧化應激反應調節密切相關的中樞調節因子[14]，Nrf2與抗氧化反應元件相互作用后調節細胞介導細胞氧化平衡及對凋亡信號的敏感度[15，16]，Nrf2的減少或缺失可導致肝星狀細胞功能障礙，減少活化狀態，加速凋亡，從而改善肝臟纖維化程度[17]。本研究成功構建針對大鼠Nrf2基因有效的shRNA慢病毒載體，通過熒光顯微鏡證實重組病毒有效感染了靶細胞，并經過PCR和Western blot檢測證實了慢病毒載體有效抑制了Nrf2的基因和蛋白的表達，與此同時利用Tunel染色發現隨著Nrf2表達水平的下降，肝星狀細胞的凋亡明顯增加，進一步證實了抑制Nrf2的表達可抑制HSC的活化。

PI3K/Akt信號通路是與細胞凋亡關系密切的膜受體信號轉導[18]，PI3K依賴性的Akt激活可以使促進細胞凋亡的蛋白Bax（BCL-2-associated X protein）的Ser136位點磷酸化而失活，從而誘發細胞產生凋亡，與此同時對Bcl-2的抗凋亡效應亦產生了抑制作用[19]。此外，被活化的Akt亦可直接作用于線粒體的細胞色素C及凋亡誘導因子，抑制其分泌，從而實現抑制細胞凋亡的目的[20]。Akt磷酸化后使得其下游關鍵蛋白分子Bad磷酸化，Bad蛋白與伴侶蛋白結合，從而使Bcl-2蛋白表達量上升，而Bax的蛋白表達量下降，從而達到抑制細胞凋亡的作用[21]。本研究通過Western blot顯示轉染慢病毒過表達載體pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA可導致PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白表達量減少，Bax蛋白及凋亡率增加，說明慢病毒介導的RNAi能有效抑制靶細胞中Nrf2基因和蛋白表達的同時可促進肝星狀細胞的凋亡，抑制其活化，減少肝纖維化程度。

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（收稿日期：2019-09-26）