Apelin-13在改善自體動靜脈內瘺血管狹窄中的機制

白桂林，劉 思

陜西省榆林市第二醫院血液凈化室，陜西榆林 719000

自體動靜脈內瘺是用于終末期腎病患者血液透析治療的一種血管通路，在臨床中應用廣泛[1]。其在血液透析患者的治療中具有較好的安全性及實用性，但隨著使用時間延長，患者可能發生自體動靜脈內瘺相關的并發癥，故防止自體動靜脈內瘺血管狹窄在終末期腎病治療中具有重要意義[2-3]。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)與血管緊張素Ⅱ1型受體(AGTR1)可以調控血管內皮細胞實際凋亡情況，也會進一步增加血管的損傷，最后因血管內膜增生導致血管狹窄形成[4-5]。內源性配體13(Apelin-13)對高血壓及動脈粥樣硬化有較好的治療效果，與此同時，能夠有效舒張腸系膜小動脈且加速血流量恢復[6]。相關研究發現，Apelin-13對AngⅡ可能具有拮抗作用，共同維持血壓平穩[7-9]。本研究選擇60例自體動靜脈內瘺患者為研究對象，分析Apelin-13水平在自體動靜脈內瘺血管狹窄患者中的臨床意義及其介導血管舒張的機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2018年1月于本院接受血液透析治療的60例患者為研究對象，將自體動靜脈內瘺血管狹窄的30例患者納入觀察組，其中男16例、女14例，平均(42.6±3.5)歲；將自體動靜脈內瘺非血管狹窄患者30例納入對照組，其中男17例、女13例，平均(42.4±3.7)歲。納入標準：(1)終末期腎病，且采取規律血液透析治療患者；(2)意識清楚，能夠正常交流；(3)采取橈動脈-頭靜脈方式進行端側吻合；(4)中度內瘺狹窄，即血液透析流量<150 mL/min，狹窄血管與鄰近血管直徑比值為0.5～0.7。排除標準：(1)惡性腫瘤；(2)嚴重感染；(3)未檢出原因的發熱；(4)既往激素治療或采取免疫抑制劑治療時間≥12個月。本研究經過本院倫理委員會批準后實施。兩組患者年齡、性別構成等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1生化指標檢測 采集患者的外周靜脈血約2 mL于抗凝管內，分離血清，檢測血清中一氧化氮(NO)水平，應用ELISA法檢測血清中Apelin-13、AngⅡ水平。

1.2.2細胞培養 人臍靜脈內皮細胞(HUVECS)購自中國科學院細胞庫，以濃度10%的胎牛血清+1640培養液在37 ℃及5% CO2培養箱中進行培養。AngⅡ刺激方案：在孔板上接種細胞，處于上述環境中進行培養約1 d，加入濃度為1 nmol/L的AngⅡ進行刺激，保證在培養箱中培養1 d。AngⅡ及Apelin-13共同刺激的方案：同樣在孔板上接種細胞，和單獨刺激的環境相同進行為期1 d的培養，加入濃度為1 nmol/L的AngⅡ及1 nmol/L的Apelin-13共同刺激，并置于培養箱內培養1 d。

1.2.3質粒轉染 參照Genebank數據庫中Apelin相關序列，設計出合成的干擾序列shApelin和無義序列Scramb兩個序列，見表1，且在pLKO.1的質粒之上進行轉染，在轉染的前1 d，接種約5×105個細胞，然后轉至6孔細胞培養板上接受培養，在轉染的0.5 h前需換用沒有血清的DMEM培養液再予以培養。將200 μL無血清的DMEM培養液、3 μg質粒、9 μL ViaFectTM轉染試劑充分混合制作成轉染液，放在室溫環境下靜置10 min左右。再將這些轉染液加入6孔板內，注意輕搖混勻再放置到細胞培養箱內持續培養約9 h，待轉染完畢之后再換用濃度10%的胎牛血清所制的DMEM培養液中進行繼續培養，時間為1 d，最后測得兩組序列，即Scramb組與shApelin組。

1.2.4免疫印跡試驗 使用免疫印跡試驗檢測所培養細胞中的磷酸化內皮型一氧化氮合酶(peNOS)、非磷酸化內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達情況。選擇二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平測定試劑盒對總蛋白水平進行測定。首先選擇40 μg蛋白完成聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗。注意每4 μL蛋白質加入約1 μL 5×SDS-PAGE的上樣緩沖液，充分混勻后，將蛋白放在100 ℃水浴中進行變性，維持5 min左右，然后冷卻至室溫后再上樣電泳，當藍色的染料到達了膠底部才可以停止電泳試驗。選擇冰水浴的時候使用100 mA的恒流進行轉膜約2 h，實現轉膜后，采用聚偏二氟乙烯膜以濃度5%脫脂奶粉在室溫環境下封閉約2 h；將抗Apelin、抗peNOS、抗eNOS、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)置于4 ℃環境下過夜進行孵育。洗滌3次后，加入經辣根過氧化物酶進行標記后的山羊抗兔二抗，再置于室溫環境下孵育約1 h；進行3次洗滌后，加入ECL顯色液且在凝膠成像儀之下進行有效曝光的拍攝。以Image J進行灰度值的測定，注意將對照組灰度值調整到1。

表1 兩個序列的設計

2 結 果

2.1觀察組與對照組血清Apelin-13水平比較 觀察組血清Apelin-13水平為(53.10±5.75)pg/mL，明顯低于對照組的(80.44±9.75)pg/mL，差異有統計學意義 (t=13.23，P<0.05)。

2.2觀察組與對照組血清中AngⅡ、NO水平比較 結果顯示，觀察組和對照組血清中AngⅡ水平分別為(173.52±11.79)pg/mL和(146.55±7.81)pg/mL，差異有統計學意義 (t=10.45，P<0.05)。觀察組與對照組NO水平分別為(54.91±5.44)μmol/mL和(72.79±8.35)μmol/mL，差異有統計學意義(t=9.83，P<0.05)。

2.3Scramb組與shApelin組Apelin-13、peNOS、eNOS表達量、NO水平比較 shApelin組的Apelin-13、peNOS表達量低于Scramb組(t=19.82、83.28，P<0.05)，但兩組eNOS表達量差異無統計學意義(t=1.52，P>0.05)。shApelin組NO水平高于Scramb組，差異有統計學意義(t=10.37，P<0.05)。見表2。

表2 Scramb組與shApelin組Apelin-13、peNOS、eNOS表達量、NO水平比較

2.4AngⅡ刺激對HUVECS的peNOS、eNOS表達量及NO水平的影響 免疫印跡試驗結果顯示，與未進行AngⅡ刺激的HUVECS對比，AngⅡ刺激后HUVECS的peNOS表達量降低(t=1.02，P<0.05)，而eNOS表達量差異無統計學意義 (t=0.60，P>0.05)。未進行AngⅡ刺激的HUVECS與AngⅡ刺激后的HUVECS細胞中NO水平分別為(29.87±6.27)μmol/mL和(22.59±3.44)μmol/mL，差異有統計學意義(t=5.58，P<0.05)。

2.5Apelin-13對AngⅡ的拮抗作用 AngⅡ刺激后的HUVECS細胞中peNOS表達量為(0.98±0.06)×103，AngⅡ、Apelin-13同時刺激的HUVECS細胞中peNOS表達量為(1.25±0.07)×103，差異有統計學意義(t=16.04，P<0.05)，但 eNOS表達量差異無統計學意義[(1.01±0.04)×103vs. (1.03±0.05)×103，t=1.71，P>0.05]。AngⅡ、Apelin-13同時刺激的HUVECS細胞所培養的上清液中NO水平為(21.46±6.38)μmol/mL，低于AngⅡ刺激的NO水平[(29.12±2.95)μmol/mL]，差異有統計學意義(t=5.97，P<0.05)。

3 討 論

自體動靜脈內瘺是指吻合動脈及鄰近的一些靜脈所組成的血管通道，目前，自體動靜脈內瘺已作為終末期腎臟病患者接受維持性血液透析治療時的首選血管通路，常用的自體動靜脈內瘺為自體橈動脈與頸靜脈的吻合[10]。臨床研究顯示，隨著自體動靜脈內瘺血液透析患者生存期的持續延長，自體動靜脈內瘺發生血管狹窄概率將增加，對血液透析治療效果及后期生活質量均產生較大影響，因此，對自體動靜脈內瘺患者術前、術后同時給予有效干預措施，對自體動靜脈內瘺血管狹窄情況的預防有重要影響意義[11-13]。Apelin是APLN基因編碼的包含77個氨基酸的前體蛋白，包括Apelin-13、Apelin-17、Apelin-36，其中Apelin-13呈現的活性較高[7,14-15]。有研究顯示，Apelin是AGTR1相關蛋白(APJ)重要內源配體，Apelin主要表達于機體的心內膜及血管內皮細胞中，而APJ主要定位在內皮、平滑肌細胞及心肌細胞[6]。另外，Apelin、APJ進行結合以后會參與多個生理反應過程，如血管收縮、動脈粥樣硬化、冠狀動脈狹窄等[16-18]。本研究對自體動靜脈內瘺血管狹窄患者及未發生血管狹窄患者的血清進行檢測，結果顯示，觀察組患者Apelin-13水平低于對照組(P<0.05)，說明Apelin-13可能對動靜脈內瘺血管狹窄存在一定緩解作用。

AngⅡ是一種重要的活性肽，參與血管張力調節及血管內皮結構生成等過程[19-20]。有報道顯示，AngⅡ通過與AGTR1受體結合，誘導機體內皮細胞開始凋亡，使血管損傷加重、內膜增生，且最終導致發生血管狹窄[21]。eNOS為血管內皮細胞生成NO過程中一種重要的合成酶，其中NO能夠保持血管張力穩定，使血管平滑肌產生一定抗炎及抗增殖作用[20-21]。本研究使用AngⅡ對HUVECS進行有效刺激后，發現peNOS表達量及NO水平均降低。本研究采用Apelin干擾序列轉染HUVECS后，也發現peNOS表達量及NO水平均降低，這提示Apelin有可能對peNOS/NO的信號通路產生正向調控效果。

本研究對Apelin-13在血液透析內瘺狹窄患者中的具體作用和機制進行了研究，但研究仍有一定不足：(1)研究只選用了存在中度自體動靜脈內瘺血管狹窄的患者作為研究對象，并沒有研究其他內瘺狹窄患者；(2)研究的細胞選擇比較單一；(3)只在患者體外細胞水平方面研究了Apelin-13、AngⅡ具備的拮抗作用。因此，還需要后續進行深入研究，采用動物模型完成實證分析。