靶向PGRMC1基因sh RNA真核表達載體的構建和鑒定

程艷 余曉紅

鄭州大學第一附屬醫院婦科 鄭州 450052

靶向基因治療是使正?；蛲ㄟ^分子生物工程或治療在腫瘤細胞中借Yinte遠程作用的手段，抑制致瘤基因或修復有缺陷的基因，使腫瘤細胞的生長受到抑制，而不影響正常細胞。國內外研究表明，孕酮受體膜成分(PGRMC1)和惡性腫瘤關系密切，在卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、子宮頸癌和其他惡性腫瘤中呈高表達，但確切的作用機制尚不清楚[1-3]。我們通過構建靶向PGRMC1基因shRNA 真核表達載體,以期抑制PGRMC1基因表達而使PGRMC1基因表達下調，為PGRMC1開展卵巢癌基因治療奠定基礎和提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人卵巢癌細胞株SKOV3細胞系購自上海研究所。RPMI1640培養基，新生小牛血清，逆轉錄(RT)-PCR試劑盒購自美國Gibco公司。限制性內切酶， DNA連接酶購自上海生工有限公司。脂質體Lipofectamine2000 ， TRIzol試劑的產品，空載體pcDNA3.1A購自美國Introvigen公司 。四氮唑藍(MTT)，氨基糖苷類抗生素G418購自Sigma公司。

1.2PGRMC1基因的設計和合成從GenBank獲取PGRMC1 mRNA 的完整序列。根據Tuschl設計原則[4],設計3條shRNA (short hairp in RNA),特異性干擾PGRMC1基因3段不同序列。設計另1條shRNA 干擾選中的shRNA 中的堿基序列作為陰性對照,經BLAST檢索確定且與PGRMC1 mRNA 及其他基因編碼序列無同源性。按照該試劑盒的使用說明，用TRIzoL 試劑提取RNA。其中1μg總RNA 在SuperScrip tTM Ⅱ逆轉錄酶的作用下反轉錄產生cDNA。PCR 引物用于擴增靶向和對照序列產物(引物序列PGRMC1正義鏈5'-GCTCTGGCTTTGCATTTGATGCA-3 ' ，反義鏈5'- AGGAGCAGAAGTTTGAAC -3')。轉染48 h后，收集細胞，漂洗2次，用冷PBS后，將細胞裂解，提取總蛋白。該產品12%的SDS-PAGE ，以蛋白質電泳轉移儀將產物轉至硝酸纖維素膜上,加入孕酮受體膜成分的抗體(1∶ 1000～1200)，4℃反應過夜，PBST洗膜，和1∶ 4000山羊抗兔IgG / HRP室溫下攪拌12 h，用化學發光試劑反應5 min，用發光成像儀成像。

2 結果

2.1PCR擴增PGRMC1基因的開放閱讀框結果RT-PCR擴增的PGRMC1產物經瓊脂糖凝膠電泳分析, 發現所擴增的條帶特異性強, 大小為2000 bp, 與預期的大小一致。見圖1。

1. PGRMC1 PCR 產物 M: DNA Marker

圖1 PGRMC1基因的PCR擴增結果

2.2組件的構建和鑒定重組質粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1 PRGMC1測序克隆pcDNA3.1 (-)/PGRMC1的表達載體，所述重組質粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1。PCR實驗陽性的菌落提取質粒DNA，用限制性酶MsqI酶切位點的酶和Smo I雙重消化，結果顯示，PGRMC1成功地建立到pcDNA3.1 (-)的真核表達載體中。

2.3篩選的細胞系和鑒定穩定轉染將pcDNA3.1 (-)/孕酮受體膜成分質粒轉染卵巢癌細胞系SKOV3，培養4周后，將孕酮受體膜成分陽性細胞穩定表達株。通過RT-PCR和轉染的pcDNA3.1的Western印跡分析(-)/孕酮受體膜成分SKOV3細胞與SKOV3細胞轉染空載體相比，表達的兩個內部基準電平基本上是相同的；而前者孕酮受體膜成分-基因表達水平顯著增加，表明重組質粒已經成功傳遞到表達(圖3，圖4)和SKOV3細胞系。

1: 未酶切的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

Undigestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

2: MspI 和SmoI雙酶切后的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

MspI and SmoI digestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

3: PGRMC1 PCR 產物product M: DNA marker

圖2 pcDNA3.1(-)/PGRMC1 雙酶切鑒定結果

圖3 通過RT-PCR檢測在PGRMC1的表達 穩定轉染SKOV3細胞系

圖4 免疫印跡檢測穩定轉染前，后SKOV3細胞系中的PGRMC1基因表達

3 討論

PGRMC1是一類小分子蛋白，含有194個氨基酸，包括1個N端跨膜結構域，1個細胞色素b5樣或亞鐵血紅/類固醇結合域。PGRMC1主要分布在后期卵黃的卵巢、肝臟和頭腎。研究發現，PGRMC1在乳腺癌、結腸癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中呈過度表達，動物實驗發現PGRMC1在卵巢中含量比較大[4-5]。且PGRMC1在卵巢癌組織中普遍呈過度表達，可促進卵巢癌細胞的增殖。PGRMC1不僅與孕激素結合，還可以與其他甾體和非甾體類物質結合。有研究發現，PGRMC1可以促進卵巢癌的發生，敲除此基因后，卵巢癌細胞的增殖受到抑制，順鉑的敏感性會增加。提出削弱PGRMC1的作用，有望作為卵巢癌靶向治療及輔助化療的一部分[6-8]。

在此研究中，我們成功構建PGRMC1到真核表達載體pcDNA3.1(-)中，通過限制性內切酶鑒定，測序，證實了靶基因的PRGMC1的正確序列，成功地建立了穩定整合在基因組中的DNA染pcDNA3.1(-)/PGRMC1-SKOV3細胞克隆時，細胞克隆的細胞進行培養，用RT-PCR和Western blot檢測PRGMC1高表達的穩定轉染卵巢癌細胞。

本實驗構建的載體經PCR電泳圖譜和測序證實了克隆RNAi打靶序列完全正確, 合成的寡核苷酸已成功載入載體。通過構建shRNA真核表達載體,成功地阻抑了PGRMC1基因在人卵巢癌細胞SKOV3中的表達,成功構建的pcDNA3.1(-) / PGRMC1 質粒 SKOV3細胞系為研究PGRMC1調節卵巢癌的分子機制及下游基因奠定了基礎，為進一步研究PGRMC1基因在腫瘤細胞發生和惡性進展的作用及探討卵巢癌基因治療新方法提供了可能。