加入芍藥苷的乳鼠心臟成纖維細胞增殖、凋亡、纖維化及TGF-β1mRNA和Smad3 mRNA表達觀察

帥壯，唐鍇，劉茂，艾嬌，馮杰，陳劍

1川北醫學院臨床醫學系，四川南充 637000；2 川北醫學院附屬醫院；3中山大學附屬第五醫院

心肌纖維化和心臟重構與多種心血管疾病的發病密切相關，而心臟成纖維細胞(CFbs)在其中發揮重要作用生理狀態下，CFbs可以通過控制細胞外基質的合成和降解來修復受損心肌[1]。病理狀態下機械或化學刺激可促進CFbs的遷移、增殖和分化，從而分泌過多的膠原纖維，促進心臟纖維化或心肌瘢痕的形成和進展[1，2]。因此，如何減輕或逆轉心肌纖維化，已成為慢性心力衰竭(CHF)研究領域的熱點和難點。免疫炎癥激活是CHF和心肌纖維化的重要因素[3,4]。因此，近年來各國學者積極探索抗炎和免疫調節治療的療效和安全性，其有望為CHF的治療帶來新的希望。芍藥苷(PF)是一個單萜類糖苷化合物，是傳統中藥芍藥的主要活性成分。PF具有多種生物活性，如免疫抑制、抗炎和減少癌細胞擴散等。此外,PF可以改善肝、腎纖維化[5，6],并可抑制TGF-β1誘導的肺動脈血管平滑肌細胞增殖[7]。我們前期研究[8]發現，PF同樣具有抗心肌細胞纖維化的作用，在本實驗中，我們進一步探索PF對CFbs增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 原代Wistar乳鼠CFbs購自CHI科技公司(江陰，No20140520HXM)。芍藥苷(純度>98%)購于金穗生物科技公司(上海)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)(純度>98%)購于美侖生物科技公司(大連)，MTT試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒、羥脯胺酸檢測試劑盒購于建成生物有限公司(南京)，TRIzol購于Invitrogen公司(美國)，qPCR試劑盒購于GeneCopoeia公司(美國)，qPCR檢測儀采用EPPENDORF(德國)，流式細胞儀采用BECKMAN COULTER(美國)。

1.2 CFbs細胞分組及CF干預方法 將原代CFbs細胞加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)培養液，置于5% CO2、37 ℃的培養箱中培養。每48 h更換培養液。當CFbs布滿瓶底時進行傳代。選擇第2～3代CFbs分為4組，h陰性對照組(CON)僅加入普通培養液培養，AngⅡ組(ANG)組在培養液中加入 10-7mol/L的Ang Ⅱ，低劑量PF組(PF-L)在 培養液中加入10-7mol/L的 Ang Ⅱ和10 μmol/L的PF高劑量PF組(PF-H)在培養液中加入 10-7mol/L的Ang Ⅱ和100 μmol/L的PF。各組細胞均于5% CO2、37 ℃中培養48 h，備用。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT法。取各組對數生長期細胞，將5×MTT用稀釋液稀釋成1×MTT溶液；每孔加入50 μL 1×MTT溶液，37 ℃、飽和濕度、5% CO2細胞培養箱中培養4 h；棄上清液，每孔加入150 μL的 DMSO，平板搖床搖勻；用酶標儀在630 nm處檢測每孔光密度(OD)值；每孔的校正OD值等于各測試孔的OD值減去空白孔OD值，各重復孔的OD值取平均數。測算各組細胞存活率。細胞存活率(%)=(加藥組細胞OD值/對照組細胞OD值)×100%。重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞羥脯胺酸(HYP)檢測 培養72 h時,取對數生長期各組細胞，嚴格按羥脯氨酸試劑盒說明檢測各組細胞HYP含量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞儀。取對數生長期各組細胞，PBS洗滌細胞，每組收集1～5×105個細胞；每管加入結合液 500 μL，輕輕混勻；加入Annexinn V-FITC 5 μL，輕輕混勻；加入碘化吡啶5 μL染色混勻，20 ℃～25 ℃避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測，Annexinn V-FITC為綠色熒光，碘化吡啶為紅色熒光；用CXP 2.0軟件獲取及分析數據。測算各組細胞凋亡率。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(早期凋亡+晚期凋亡)/細胞總數×100%。重復 3 次，取平均值。

1.6 各組細胞TGF-β1、Smad3 mRNA檢測 采用qPCR法。取各組細胞，加入1 mL TRIzol，吹打混勻，室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，振蕩混勻30 s，室溫靜置15 min；4 ℃下12 000 g離心15 min,吸取上層水相至無RNase 離心管；加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10 min；4 ℃下，12 000 g離心10 min，棄上清，收集RNA沉淀；加入75%乙醇，振蕩懸浮沉淀，4 ℃下，8 000 g離心5 min，棄上清風干；加入60 μL DEPC水溶解沉淀，萃取CFbs細胞總RNA；利用All-in-One試劑盒逆轉錄cDNA，內參選用β-actin。引物序列如下: TGF-β1(F) 5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′, TGF-β1(R) 5′-TGGTTGTAGAGGGCAAG GAC-3′, Smad3(F) 5′-GGCAGGATGTTTCCAGCTA-3′,Smad3(R) 5′-GCAGTCC ACAGACCATGTCA-3′, β-actin(F) 5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′, β-actin (R) 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。以2-ΔΔCT值代表目的基因相對表達量，重復3次取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞OD值比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細胞OD值分別為0.348±0.065、 0.076±0.009、0.084±0.009、0.193±0.025 ，與CON組比較，ANG組細胞OD值升高；與ANG組比較，PF-L組及PF-H組OD值降低(P均<0.05)。鏡下可見，CON組CFbs細胞貼壁良好，排列整齊有序。與CON組相比，ANG組CFbs貼壁緊密，顯著增殖，排列不規則。與CON組相比，PF-L組和PF-H組CFbs細胞數量顯著減少，可見少許死亡細胞漂浮。見圖1。

注：A為CON組；B為ANG組；C為PF-L組；D為PF-H組

2.2 各組細胞HYP含量比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細胞HYP含量分別為(1.432±0.536)、(0.399±0.287)、(0.600±0.201)、(1.132±0.499)μg/mL,與CON組比較，ANG組細胞HYP含量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組細胞HYP含量降低(P<0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細胞凋亡率分別為1.136±0.525、1.088±0.547、2.521±0.251、3.437±0.612，與ANG組比較，PF-L組、PF-H組細胞凋亡率升高(P均<0.05)。

2.4 各組細胞TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達量比較 ANG組、PF-H組、PF-L組TGF-β1mRNA相對表達量分別為1.364±0.123、0.166±0.049、0.536±0.098，與CON組比較，ANG組TGF-β1mRNA相對表達量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組TGF-β1mRNA相對表量降低(P<0.05)。ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組Smad3 mRNA相對表達量分別為1.528±0.138、0.156±0.03、0.489±0.054，與CON組比較，ANG組Smad3 mRNA相對表達量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組Smad3 mRNA相對表量降低(P<0.05)。

3 討論

心肌纖維化主要表現為成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質過度沉積，可導致心肌組織缺血缺氧，降低心室壁順應性以及收縮功能，促使心功能減退[1,3,9]。心肌纖維化涉及腎素—血管緊張素—醛固酮系統、免疫系統、炎癥因子、生長因子TGF-β等多種因素的參與[3,9]。AngⅡ可以促進成纖維細胞增殖、膠原沉積，從而引起心肌纖維化[10]。本研究采用AngⅡ來誘導心肌增殖。HYP是膠原組織的主要成分之一，是膠原中特有的氨基酸成分，約占膠原氨基酸總量的13%，其表達水平可間接反映心肌膠原的含量，在本研究中，我們通過對各組HYP含量進行檢測，評估PF對CFbs膠原分泌的影響，結果發現AngⅡ誘導的CFbs的HYP含量顯著高于正常組，PF-H組HYP含量較低，表明PF可抑制CFbs的膠原分泌。

研究[8]發現，PF可改善心肌重塑，但發揮這一作用的具體機制尚不清楚。在本研究中，通過在AngⅡ培養的CFbs模型中加入不同濃度的PF，結果發現，與正常組及ANG組相比，PF組細胞數量明顯減少，且這一作用與PF成劑量依賴性。表明PF具有抑制CFbs的增殖、促進其凋亡的作用。李健哲等[11]研究發現，PF具有抗纖維化的作用，且PF濃度越高，實驗組成纖維細胞增殖活性及膠原含量越低。由于我們并未單獨設立PF組，因此我們并不清楚PF是否對成纖維細胞的增殖和凋亡起著直接調控作用。但李健哲等[11]研究發現，單獨使用PF處理的成纖維細胞，其細胞數及膠原含量無明顯變化，由此我們可以推斷，PF是通過調節某種體液因子間接調控心肌纖維化，由于AngⅡ是一種重要的促纖維化因子，因此我們認為PF的抗纖維化作用可能是由于其阻斷了AngⅡ的促纖維化作用。

既往研究[10,12,13]發現，AngⅡ通過調控生長因子TGF-β表達，參與了心肌纖維化的過程。TGF-β的激活促使心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，加速細胞外基質的合成與分泌，并抑制膠原的降解從而導致心肌纖維化進行性加重,在心臟重構和纖維化中扮演著重要的作用[9,14,15]。在哺乳動物中，TGF-β存在三種形式：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，以TGF-β1為主[15]。Smads是TGF-β1信號通路中下游主要效應分子，包括受體激活型Smads(R-Smads)如Smadl、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，共同通路型Smads(Co-Smads)如Smad4，抑制型Smads(Ⅰ-Smads)如Smad6、Smad7。R-Smads主要參與纖維化的過程，Co-Smads是TGF-β必要的信號中轉分子，在信號轉導中起承接作用，Smad4不會直接與受體發生相互作用，但是能直接與DNA結合來調控有關基因的表達,而Smad7作為負性調控因子，可競爭性的與TGF-β1受體結合形成受體復合物，阻斷TGF-β1的細胞內效應，從而抑制纖維化的發生[15]。TGF-β通過與Ⅰ和Ⅱ型TGF-β受體結合，激活下游Smad2/3信號通路，促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，加速細胞外基質的合成與分泌，并抑制膠原的降解從而導致心肌纖維化進行性加重[9]，此外，TGF-β也參與了其他促纖維化細胞因子的合成和分泌[9]，共同促進了心臟纖維化的發生。本研究中，AngⅡ可上調TGF-β1、Smad3 mRNA表達。加入PF可抑制CFbs增殖、凋亡，抑制HYP表達，其可能機制為PF抑制細胞TGF-β1及Smad3 mRNA表達。相反，PF則阻斷了AngⅡ的這一作用，抑制了TGF-β1/Smad3信號通路的表達，且PF濃度越高，對TGF-β1/Smad3信號通路的抑制越明顯。因此，我們認為，PF可能是通過抑制AngⅡ促進TGF-β1/Smad3信號通路的表達發揮了抑制CFbs的增殖的作用。

綜上所述，PF可通過抑制CFbs的增殖、促進CFbs凋亡、抑制CFbs膠原的分泌,達到抗纖維化的目的，這一作用與抑制AngⅡ對TGF-β1/Smad3信號通路的激活密切相關，但是否通過其他分子影響了TGF-β1/Smad3信號通路的表達或影響了其他Smad分子尚不清楚,有待于進一步研究。