硒蛋白微膠囊的制備、結構表征及體外消化特性研究

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(1.武漢輕工大學國家富硒農產品加工技術研發專業中心,湖北省綠色富硒農產品精深加工工程技術研究中心,湖北武漢 430023; 2.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;3.武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023;4.國家富硒產品質量監督檢驗中心,湖北恩施 445000)

硒(Se)是人體必需微量元素之一,在體內主要以硒蛋白、硒酶、硒核糖核酸以及硒多糖等多種有機硒形式存在[1-2],且基本存在形式為硒蛋白[3],具有抗氧化、提高機體免疫力[4]、防治克山病和大骨節病的功能。施怡等[5]通過栽培過程中添加不同用量Na2SeO3的方式培養雙孢蘑菇,發現蛋白含硒量占比77%～87%,為主要有機硒載體。李春霞等[6]采用硒營養液培育的藍莓飼養小鼠,與對照組相比血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶分別升高了45.93%和55.94%。張浩等[7]通過對糖尿病模型的小鼠灌胃,發現富硒青錢柳多糖較青錢柳多糖具有明顯提高糖尿病小鼠免疫力的功效。

利用生物轉化因子將無機硒轉化成有機硒,可用于開發富硒食品[8-9]。其中,通過添加植物硒蛋白是一種常見的富硒強化食品加工方法。然而,植物硒蛋白作為一種生物活性物質,在強酸堿或過熱等環境中易被破壞,另外由于其特殊氣味,限制了硒蛋白在食品加工中的應用。微膠囊化是一種常用的嵌入活性物質的技術。該技術不僅可以穩定活性物質,還可以控制活性物質的釋放速率,增加活性物質的利用率。相關領域已受到國內外學者的重視。如,張生生等[10]通過銳孔法制備表面活性肽微膠囊,腸液緩釋試驗中9 h累計釋放91.7%,獲得了有效的緩釋性能。袁靖琳等[11]則以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材包埋水牛乳活性肽,制備的微膠囊能夠較好的保護目標肽、達到了緩釋效果。龍門等[12]利用海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體,固化的JS25噬菌體穩定性顯著增加,并且對液態食品具有較高生物防治作用。Khorramvatan等[13]通過調整海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度以及攪拌速度來優化蘇云金芽孢桿菌微膠囊的制備工藝,以此提高其在紫外輻射下的穩定性。本課題組前期通過復合酶處理研制多孔淀粉壁材[14],并用于橄欖油微膠囊化,在改善液體油使用方便性的同時顯著改善了其氧化穩定性[15]。微膠囊技術已經得到了廣泛的應用,但關于硒蛋白微膠囊的制備及性能研究鮮有報道。鑒于此,本研究擬采用海藻酸鈉為壁材,通過銳孔凝固浴法微囊化硒蛋白,通過結構表征以及模擬胃腸液消化試驗進一步對其結構特征與體外消化特性進行了探討,以期提高硒蛋白的穩定性和生物利用度,為富硒食品的開發創立一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物硒蛋白 由國家富硒農產品加工技術研發專業中心(武漢輕工大學)提供;海藻酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司;胃蛋白酶和胰酶 Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;氯化鈣 天津科密歐化學試劑有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

Vario EL Cube元素分析儀 德國元素分析系統有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機 西盟國際集團金西盟(北京)有限公司;SB-5200DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL16冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司;S-3000N掃描電子顯微鏡 日立儀器(上海)有限公司;NEXUS670傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司;TGA/DSC/1100SF熱失重分析儀 梅特勒-托利多儀器(上海)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硒蛋白微膠囊的制備 分別配制一定濃度的海藻酸鈉溶液以及一定濃度(w/v)的CaCl2溶液各10 mL。準確稱取0.05 g硒蛋白與海藻酸鈉溶液混合,置于一定的超聲波清洗機中作用20 min。恒流泵勻速推動裝有硒蛋白-海藻酸鈉混合物的注射器活塞(0.2 mL/min),維持其在銳孔處均勻滴入凝固浴,期間磁力勻速攪拌(200 r/min),完成固化造粒。利用蒸餾水抽濾洗滌,洗脫表面硒蛋白,將濕態微膠囊于-20 ℃條件下預凍24 h后,置于真空冷凍干機中干燥48 h,得負載硒蛋白微膠囊,備用。

1.2.2 包埋率的測定 采用元素分析法測定硒蛋白含量:準確稱量每份樣品質量,分別取(5±0.25) mg硒蛋白微膠囊,測定樣品中氮元素百分比,包埋率的計算方式具體見如下公式。

式中:N為硒蛋白微膠囊中的氮元素百分比(%);m1為每份樣品質量(g);m2為每份樣品中添加硒蛋白質量(g),其純度為40%;6.25為蛋白質換算系數。

1.2.3 硒含量的測定 利用原子熒光光譜法測定硒蛋白中硒含量[16],進而通過包埋率計算硒含量。

式中:N為硒蛋白微膠囊中的氮元素百分比(%);C為硒蛋白中硒含量(μg/g),其純度為40%;6.25為蛋白質換算系數。

1.2.4 單因素實驗 固定海藻酸鈉濃度為2.0%(w/v)和包埋操作溫度為20 ℃,分別配制濃度(w/v)為1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%的CaCl2溶液,重復1.2.1節中微囊化工藝制備硒蛋白微膠囊,按照1.2.2節計算包埋率,分析CaCl2溶液濃度對硒蛋白包埋率的影響。

固定CaCl2溶液濃度為2%(w/v)和包埋操作溫度為20 ℃,分別配制濃度(w/v)為0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%的海藻酸鈉溶液,重復1.2.1節中微囊化工藝制備硒蛋白微膠囊,按照1.2.2節計算包埋率,分析海藻酸鈉濃度對硒蛋白包埋率的影響。

固定CaCl2溶液濃度為2%(w/v)和海藻酸鈉濃度為1.6%(w/v),操作溫度分別為10、20、30、40、50 ℃,重復1.2.1節中微囊化工藝制備硒蛋白微膠囊,按照1.2.2節計算包埋率,分析操作溫度對硒蛋白包埋率的影響。

1.2.5 響應曲面優化試驗 綜合單因素實驗結果,確定因素水平優化范圍,依據Box-Benhnken的中心組合設計原理,以硒蛋白包埋率為響應值,設計三因素三水平響應面優化試驗(見表1)。

表1 實驗設計因素及水平設計Table 1 Factors and levels of experiment

1.2.6 硒蛋白微膠囊的結構表征

1.2.6.1 硒蛋白微膠囊的微觀形貌及粒徑分析 用導電膠將適量硒蛋白、硒蛋白微膠囊和空白微膠囊固定到樣品臺上,經真空鍍金后,使用掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品微觀形貌進行觀察,并結合圖像分析軟件(Image J 1.51)測定統計樣品的粒徑分布。

1.2.6.2 硒蛋白微膠囊的紅外光譜分析 通過KBr壓片法,采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)分析硒蛋白、硒蛋白微膠囊和空白微膠囊的分子結構和主要官能團。掃描范圍4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描16次。

1.2.6.3 硒蛋白微膠囊的熱重分析 稱取約5 mg硒蛋白、硒蛋白微膠囊和空白微膠囊,采用熱重分析儀(TGA),以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃升溫至800 ℃,觀察其熱失重行為。保護氣體為N2(流速為20 mL/min)。

1.2.7 體外釋放特性研究 體外模擬消化試驗參照已報道的方法[17-18]并作修改:分別取10份硒蛋白微膠囊和空白微膠囊,每份0.1 g,置于西林瓶中,并在瓶中加入10 mL的模擬胃液(pH=2.0),于(37.0±0.5) ℃恒溫搖床中震蕩,震蕩速度為100 r/min,分別在0.5、1.0、2.0 h取出3份用于測定微膠囊在胃液中相對釋放率,其余轉移至腸液中,分別3、5、7、9、11、13、15 h測定微膠囊在腸液中的相對釋放率。在勻漿機10000 r/min破碎攪勻,4000 r/min離心10 min,取上清液用Bradford蛋白濃度試劑盒測定樣液中的硒蛋白含量,減去空白干擾,計算相對釋放率,以相對釋放率對時間繪制出釋放曲線。

式中:n為測定樣品中的硒蛋白含量(g);m3為每份消化液中添加微膠囊樣品質量(g);T為包埋率(%)。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0和Design Expert 8.0進行數據統計分析,顯著性水平為P<0.05,作圖采用Origin 9.0。

2 結果與分析

2.1 負載硒蛋白微膠囊的制備

海藻酸鈉為電解質聚合物,且-COO-帶負電荷,采用銳孔凝固浴法將混合均勻的硒蛋白和海藻酸鈉滴入CaCl2溶液中,Ca2+將填入古洛糖醛酸和甘露糖醛酸單元之間的空隙中,并與-COO-通過螯合作用相互交聯[19],示意圖如圖1a所示,濕態和凍干后的微膠囊外觀圖片分別如圖1b、圖1c所示。

圖1 硒蛋白微膠囊的制備Fig.1 Preparation of selenoprotein microcapsules注:a為硒蛋白包埋示意圖,b為濕態硒蛋白微膠囊,c為干態硒蛋白微膠囊。

2.2 單因素實驗

2.2.1 CaCl2濃度對硒蛋白包埋率的影響 如圖2所示,當CaCl2濃度在1.2%～2.0%范圍,硒蛋白包埋率隨CaCl2濃度的增加而增大,而在2.0%～2.8%范圍,隨著CaCl2濃度的增加包埋率有所降低。當CaCl2濃度較低時,由于Ca2+直接參與交聯,溶液的凝膠化又限制了Ca2+的流動,使得局部地區交聯不夠,無法形成致密保護層,故而包埋率較低。隨著Ca2+的增加,更多的Ca2+填入古洛糖醛酸單元之間的空隙,與其以及甘露糖醛酸中的-COO-通過螯合作用相互交聯[19],導致核-殼式結構更加穩定,從而包埋率增加,當Ca2+濃度大于2.0%,包埋率開始下降,可能是因為Ca2+進一步增加,三維結構開始收縮[20],在洗滌干燥過程中微膠囊表面破裂,致使硒蛋白流失?？疾霤aCl2濃度對硒含量的影響發現其趨勢與包埋率變化趨勢基本相同,因而,在實驗中選擇2.0% CaCl2濃度作為最適濃度。

圖2 CaCl2濃度對硒蛋白包埋率和硒含量的影響Fig.2 Effects of CaCl2 concentration on selenoprotein encapsulation rate and selenium content

2.2.2 海藻酸鈉濃度對硒蛋白包埋率的影響 如圖3所示,當海藻酸鈉濃度在0.8%～1.6%范圍,硒蛋白包埋率呈穩定上升趨勢,而濃度由1.6%增至2.4%時,包埋率降低;當海藻酸鈉濃度為1.6%時達到最大包埋率82.4%。以上變化是由于在Ca2+濃度不變的前提下,海藻酸鈉濃度增加,溶液中線性高分子的海藻酸鈉會更多的結合Ca2+交聯形成網狀骨架(如圖1a),使得核-殼式結構加穩定[21-22],凝膠強度增加,進而提高包埋率;但隨著海藻酸鈉濃度的進一步增加,體系粘度增大,銳孔處造粒壓力增大,造粒困難,使得微囊固化后呈不規則形狀或有拖尾現象,導致包埋率降低。每份樣品添加硒蛋白的質量一定,但海藻酸鈉的添加量不同,樣品質量會不同,故而在海藻酸鈉濃度為0.8%時硒含量會較高,而在濃度為2.0%～2.4%時會降低。綜上,選擇1.6%作為海藻酸鈉的最適濃度。

圖3 海藻酸鈉濃度對硒蛋白包埋率和硒含量的影響Fig.3 Effects of sodium alginate concentration on selenoprotein embedding rate and selenium content

2.2.3 包埋操作溫度對硒蛋白包埋率的影響 如圖4 所示,硒蛋白包埋率隨著溫度的上升呈增加趨勢。這是由于升高溫度加劇了海藻酸鈉分子鏈段的運動,分子鏈得以舒展,進而海藻酸鈉與Ca2+的交聯反應加快?？紤]到硒蛋白為活性物質,操作溫度上限選擇50 ℃?？疾煳?其趨勢變化與包埋率基本相同,故最適包埋操作溫度選擇50 ℃。

圖4 包埋操作溫度對硒蛋白包埋率和硒含量的影響Fig.4 Effect of embedding operation temperature on selenoprotein embedding rate and selenium content

2.3 響應面分析

2.3.1 Box-Benhnken試驗設計與結果 響應面試驗結果見表2,利用Design expert 8.0進行多元回歸擬合,得到以包埋率為響應值(Y)對海藻酸鈉濃度(A)、包埋操作溫度(B)和CaCl2濃度(C)三個因素的二次多項回歸方程如公式

表2 Box-Behnken中心組合試驗設計與結果Table 2 Box-Behnkencentral composite design matrix and corresponding experimental results

2.3.2 回歸方程顯著性分析 為了考察模型擬合度,對回歸方程進行方差分析,結果如表3所示。該模型P<0.0001,說明該模型極顯著,回歸方程能夠很好的反應出各因素與響應值之間的關系。通過P值檢驗發現,一次項B、C、交互項AB、二次項A2、C2的P值小于0.01,說明其對硒蛋白包埋率的影響極顯著。一次項A、交互項AC的P值小于0.05,表明其對硒蛋白包埋率的影響顯著。而交互項BC、二次項B2的P值大于0.05,說明其對硒蛋白包埋率的影響不顯著。由F檢驗可以的出因子貢獻率為包埋操作溫度(B)>CaCl2濃度(C)>海藻酸鈉濃度(A)。經過模型可信度分析失擬項P值0.05003>0.05,對模型式有利,無失擬因素存在,因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。調整決定系數0.9804>0.80,其中變異系數為0.89%,說明該模型只有0.196%的變異,進一步說明模型擬合度較好。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the established regression equation

Y=86.63+0.67A+3.34B+1.37C+2.14AB-1.14AC+0.51BC-8.05A2-0.079B2-1.93C2

2.3.3 響應曲面分析 依據各因素對硒蛋白包埋率的影響,選擇海藻酸鈉濃度、包埋操作溫度、CaCl2濃度3個因素。根據回歸擬合函數,每2個因素對硒蛋白包埋率畫出響應面和等高線圖(如圖5所示),依次分別為AB、AC、BC交互的響應面圖。AB、AC交互項的響應面圖曲線較陡,響應面變化較大,表現為對硒蛋白包埋率影響顯著,而BC交互的響應面較為平滑，響應值變化較小,說明其對硒蛋白包埋率影響不顯著。這與方差分析中的P值檢驗結果一致。

圖5 各因素相互作用對包埋率的影響Fig.5 Effect of factor interaction on embedding rate注:a為包埋溫度與海藻酸鈉濃度,b為CaCl2濃度與海藻酸鈉濃度,c為CaCl2濃度與包埋溫度。

2.3.4 響應曲面優化包埋工藝 利用Design expert軟件計算出最佳微膠囊制備工藝:CaCl2濃度為2.0%、包埋溫度為49 ℃、海藻酸鈉濃度為1.6%,此時包埋率達到89.7%,根據回歸方程的得出的最優工藝條件進行實際的驗證,進行3次重復性驗證,得到微膠囊包埋率為87.4%,與回歸方程得出的理論值相比下降了2.3%。驗證值與預測值的相對誤差為2.46%,誤差較小,表明試驗建立的模型優化結果具有可靠性。

2.4 微膠囊結構表征

2.4.1 微觀形貌分析及粒徑分析 為了觀察硒蛋白微膠囊的包埋形態,通過掃描電子顯微鏡對硒蛋白(圖6a)、空白微膠囊(圖6b)以及硒蛋白微膠囊(圖6c)的微觀形貌進行分析。由電鏡圖可以看出硒蛋白呈均勻球形,空白微膠囊表面致密,而對硒蛋白進行包埋之后,表面有圓球狀物質被緊密包裹,證實硒蛋白成功被包埋。由圖6d、圖6e可以看出,負載硒蛋白微膠囊的粒徑主要集中在750～900 μm范圍內,占比達到了86%,平均粒徑為(848.1±60.2) μm。

圖6 掃描電子顯微鏡圖及粒徑分布圖Fig.6 Scanning electron micrograph and the particle size distribution map注:a為硒蛋白(2000×),b為空白微膠囊(100×),c為硒蛋白微膠囊(500×),d為硒蛋白微膠囊(30×),e為粒徑分布圖。

2.4.2 紅外光譜分析 在觀察到硒蛋白被包埋入微膠囊的基礎上,進一步借助FTIR分析分子結構的差異。圖7分別為硒蛋白、空白微膠囊和負載硒蛋白微膠囊的紅外譜圖。硒蛋白的紅外吸收譜線如譜線a所示,883 cm-1附近出現特征峰,可能是Se與蛋白形成共價鍵引起的;1051和1089 cm-1附近出現兩個吸收峰,是由于C-O鍵的振動;1240 cm-1為酰胺III帶的特征吸收峰,來至于C-N的伸縮振動[23];2977 cm-1附近的吸收峰對應C-H的伸縮振動[24];3270～3420 cm-1的寬峰是由-NH2的伸縮振動引起的。譜線b為空白微膠囊紅外譜線,分別在1427和1614 cm-1附近出現吸收峰,歸因于海藻酸鈉-COO-的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動;3434 cm-1出現寬而強的吸收峰是由于海藻酸鈉分子間形成氫鍵[25]。譜線c中海藻酸鈉對硒蛋白進行包埋后得到的硒蛋白微膠囊,在883、1280、1430、1616 cm-1分別出現了硒蛋白和海藻酸鈉的特征峰,而在3400 cm-1近峰值的增大,是因為-NH2的存在和分子內氫鍵共同作用的結果。以上結果進一步證實了海藻酸鈉形成的微膠囊結構成功負載了硒蛋白,這與SEM結論一致。

圖7 硒蛋白微膠囊紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of selenoprotein microcapsule注:a為硒蛋白,b為空白微膠囊,c為硒蛋白微膠囊。

2.4.3 熱重分析 利用TGA考察硒蛋白和微膠囊的熱分解行為。如圖8所示,從30 ℃升溫至100 ℃,硒蛋白質量下降了8.2%,這歸因于樣品中自由水分的減少。由于凍干后的微膠囊具有一定的吸濕性,其內部吸附水分較多,因此空白微膠囊和硒蛋白微膠囊質量損失分別下降13.4%、10.9%。隨著溫度的繼續升高,在100～132 ℃,硒蛋白的熱分解速率趨于平緩,出現一個平臺,但隨著溫度的進一步提高,硒蛋白開始受熱分解,質量急劇下降。而空白微膠囊和硒蛋白微膠囊分別在217.1和211.8 ℃開始進入劇烈熱分解階段,在517 ℃附近再次進入平臺區,質量分別下降了35.6%、40.7%,而硒蛋白此時質量下降60.3%,表明硒蛋白熱穩定較差,而包入海藻酸鈉微膠囊的殼層后對其起著保護作用,提高了熱穩定性。

圖8 硒蛋白微膠囊熱重分析曲線圖Fig.8 TGA curves of selenoprotein microcapsule

2.5 體外釋放特性研究

減少硒蛋白被胃液的破壞,控制其緩慢持續釋放對其生理活性的發揮具有重要意義。本研究在前2 h考察了負載硒蛋白微膠囊在模擬胃液中的釋放行為,后轉到模擬腸液中,進行另外1～13 h測試(對應圖9中3～15 h)。如圖9所示,負載硒蛋白微膠囊在模擬胃液中消化2 h,硒蛋白累計釋放8.9%,進入模擬腸液后,硒蛋白迅速釋放,經13 h模擬腸液消化后,釋放已經接近飽和,此時的釋放量高達88.2%,說明了海藻酸鈉與Ca2+形成的微囊能夠在模擬胃酸的條件下能夠穩定存在且不被破壞,具有較好的抵抗模擬胃液(pH=2.0)消化的能力,而在相對溫和的模擬腸液(pH=6.8)中發生溶脹并緩慢釋放,即采用海藻酸鈉為壁材制備的負載硒蛋白微膠囊具有腸溶性。以上研究有望實現硒蛋白的緩釋、靶向輸送以及提供高生物利用度,有望應用于富硒功能食品的開發。

圖9 硒蛋白微膠囊體外模擬消化累計釋放曲線Fig.9 Continuous release curve of selenoprotein microcapsules in the in vitro digestion system

3 結論

本研究以海藻酸鈉為壁材,采用銳孔凝固浴法制備負載硒蛋白微膠囊,在單因素試驗的基礎上結合響應面分析法得到硒蛋白微膠囊最佳工藝條件:海藻酸鈉濃度1.6%(w/v)、CaCl2濃度為2%(w/v)和包埋操作溫度49 ℃。在此條件下硒蛋白包埋率為87.4%,平均粒徑為(848.1±60.2) μm。經過海藻酸微膠囊包埋后,硒蛋白的特殊氣味得到了有效掩蓋。通過SEM結果可以直觀觀察到硒蛋白被完整有效的包裹在海藻酸鈉微膠囊中,而FTIR和TGA分別從分子結構和熱失重曲線變化上驗證了這一結果。此外,TGA分析還證實了硒蛋白經海藻酸微膠囊包埋后,其熱穩定性得到了明顯的提高。此外,微囊化的硒蛋白有效減少其在胃液中的破壞,提高其在腸液中的緩釋能力,表現為在模擬胃液中消化2 h僅釋放8.9%,在模擬腸液中消化13 h后累計釋放88.2%。

以上研究結論為硒蛋白的高值化利用及在富硒食品加工中的穩定性與生物利用提供了理論基礎。在后續工作中,將進一步研究硒蛋白在腸道的分布滲透和保留吸收以及功能性評價,推進其作為有效硒助劑應用于富有機硒食品的開發。