棉花連作土壤中二甲戊靈降解優勢菌的分離及其降解能力

韓亞杰1,王丹琪1,包慧芳

(1.石河子大學化學化工學院,新疆石河子 832003;2.新疆農業科學院微生物應用研究所,新疆烏魯木齊 830091)

施加化肥和農藥是保障農業增產增收的有效措施,預計2020年全球農藥市場規?？蛇_600億美元以上[1]。隨著人們環保意識的增強,農藥的毒性問題和殘留問題越來越受到關注。農藥可以導致水生生物中毒和死亡,其中殺蟲劑和除草劑是這類事故的主要“元兇”[2]。1992年,美國地下水中含50多種農藥,其中涕滅威的濃度高達515 ng/L,1994年地下水中可檢測的農藥品種上升至157種,并且在湖泊中的魚類體內檢測到滴滴涕、艾氏劑等有毒農藥[3]。自上世紀中葉開始,農藥降解菌陸續被分離,對其降解代謝途徑及關鍵降解基因也進行了較為詳細的研究。研究發現真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),米曲霉菌(Aspergillusoryzae),香菇(Lentinulaedodes),短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)和蠟蚧菌(Lecanicilliumsaksenae)可以在液體培養中對特丁津和二甲戊樂靈進行生物降解[4]。

除草劑二甲戊靈上市已經40年,主要應用于棉花、玉米和煙草的田間除草劑[5-7],在新疆應用較為廣泛。二甲戊靈的化學結構比較復雜,施用后在土壤中的吸附性強,而且很難被解吸,持效期長。除草劑二甲戊靈已經被美國環境保護署EPA正式列入持久性生物累積性有毒物質(PBT)名單,它可引發小鼠罹患甲狀腺濾泡細胞腺瘤,對水體里的魚類和無脊椎生物高毒,同時也是人類潛在的致癌物[8-9]。近些年,國內外報道了利用微生物或者是微生物產生的酶去降解二甲戊靈,主要集中在土壤中二甲戊靈降解菌的分離、純化,涵蓋了細菌和真菌[10-14],但是關于酵母菌降解二甲戊靈的報道較少。由于酵母菌具有耐滲透壓、耐酸以及高的代謝效率等特點,因此在降解有機污染物方面同樣具有重要的作用。人們還發現酵母菌在分解有機污染物時會產生豐富的酵母蛋白,即美化了環境又可以對代謝產生的蛋白進行綜合利用[15]。周江亞等[16]分離了1株降解苯酚的熱帶假絲酵母菌,對苯酚的降解率高達99.10%。劉斌斌等[17]分離了一株對甲胺磷具有極高降解活性的魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii)WY3后發現,經過WY3處理12 h后的樣品未檢出甲胺磷。肖琳等[18]利用酵母菌降解苯二甲酸工業廢水,對酵母菌代謝產生的細胞蛋白進行小鼠的急性毒性、蓄積毒性和致突變試驗分析,研究顯示小鼠內臟未見病變,同時發現小鼠很喜歡吃酵母菌代謝產生的細胞蛋白。由此得知,酵母菌對有機污染物的生物降解是一種可持續發展的技術手段,其可將有機污染物轉化為細胞蛋白,優越性可見一斑。

本文從棉花連作并常年施加除草劑二甲戊靈的土壤中分離了5株降解二甲戊靈的優勢菌,并研究了降解能力最高菌株XSP6的降解性能,以期對農藥污染的水體和土壤生物修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二甲戊靈標準品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;33%的施田補乳油 江蘇豐山集團有限公司;石油醚 分析純,天津永晟精細化工有限公司;無機鹽培養基 NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g,按需加入不同質量的蔗糖,1000 mL去離子水,自然pH,高壓滅菌;PDA培養基馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,1000 mL自來水,自然pH,高壓滅菌。

MLS-3750型高壓滅菌鍋 日本三洋公司;SW-CJ-ZFD型超凈工作臺 上海博訊實業有限公司;LRH-150型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;ZQZY-70BS型恒溫振蕩器 上海知楚儀器有限公司;5418R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;R-210型旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI科技有限公司;LC-10A型高效液相色譜儀 日本島津;Axio Observer型熒光倒置顯微鏡 德國ZEISS公司;FR-980型凝膠成像儀 上海復日科技有限公司;PCR擴增儀 BIO-RED伯樂;UV-2100紫外可見分光光度計 優尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 二甲戊靈降解菌的富集篩選 配制土壤稀釋液(土壤∶無菌水=1∶10),28 ℃振蕩培養30 min,靜止后吸取上層清液,按著5%的量接種到含二甲戊靈100 mg/L的無機鹽培養液中,28 ℃振蕩培養5 d取適量富集液接種到含二甲戊靈200 mg/L的無機鹽培養液中,如此轉接直至二甲戊靈的濃度達到4500 mg/L。取富集后的菌液利用稀釋平板涂布法獲得單菌落,再經過三次劃線得到純菌,以15%甘油管保存在-80 ℃冰箱。

1.2.2 二甲戊靈降解優勢菌的復篩 挑選5株生長良好的酵母菌分別接種至10 mL無機鹽培養液,控制初始二甲戊靈濃度為300 mg/L、蔗糖含量為0.5%,分裝至錐形瓶中,再向每個錐形瓶中加入培養至對數生長期的菌懸液0.8 mL,置恒溫振蕩培養箱28 ℃、120 r/min培養。培養結束后加入5 mL飽和NaCl溶液,用30 mL石油醚萃取,萃取液經旋轉蒸發儀濃縮,吹干后加入3 mL色譜純甲醇溶解定容,經0.22 μm尼龍(NY)濾膜過濾,高效液相色譜法進行測定。本實驗采用標準曲線法進行定量。

1.2.3 菌株形態觀察和生理生化鑒定 使用顯微鏡對分離菌株進行形態學觀察。同時進行菌株的生理生化測定[1,3]。

1.2.4 26S rRNA鑒定 按照Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母菌XSP6的基因組DNA。以酵母菌XSP6的基因組DNA為模板,利用通用引物NL1-F和NL1-R對菌株的26S rRNA的基因片段進行擴增,正向引物NL1-F:5′-GCATATCAATAA GCGGAGGAAAAG-3′,反向引物NL1-R:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。酵母菌26S rRNA基因基因擴增體系:0.5 μL基因組DNA;2.5 μL 10×Buffer;1 μL dNTPs(2.5 mmol/L);0.5 μL引物NL1-F(10 μmol/L);0.5 μL引物NL1-R(10 μmol/L);0.2 μL Easy-Taq DNA polymerase(5 U/μL);25 μL ddH2O。PCR 擴增循環參數為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳條件150 V、100 mA。PCR產物由生工生物工程有限公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)搜索[19],并與數據庫中已上傳的26S rRNA基因序列進行同源性對比,并利用Mega 5.0進行系統發育分析。

1.2.5 酵母菌XSP6降解率的測定

1.2.5.1 二甲戊靈濃度 調整二甲戊靈濃度分別為50、150、300 mg/L,分裝于錐形瓶后接種培養,5 d后取出無機鹽培養基,使用石油醚萃取降解產物,最后以HPLC法測定并計算農藥的降解率。

1.2.5.2 接種量 根據上述試驗的結果選擇適宜的二甲戊靈濃度,調整接種量分別在1%、1.5%、2.5%、5%,5 d后取出無機鹽培養基,使用石油醚萃取降解產物,最后以HPLC法測定并計算農藥的降解率。

1.2.5.3 外加碳源 根據上述試驗結果選擇適宜的二甲戊靈濃度和接種量,配制含碳源蔗糖0.5%、1.0%、1.5%、2.0%不同濃度的無機鹽培養液,5 d后取出無機鹽培養基,使用石油醚萃取降解產物,最后用標準曲線法進行定量,同時計算農藥的降解率。

1.2.6 降解率的測定 高效液相色譜條件:C8色譜柱(Waters公司),甲醇∶水(85∶15)為流動相,流速為1 mL·min-1,柱箱溫度為30 ℃,檢測波長為238 nm[20]。本實驗采用標準曲線法進行定量。配制標準樣品濃度為50、100、150、300、500 mg/L,用色譜純甲醇定容至10 mL的容量瓶中,混勻;經0.22 μm尼龍(NY)濾膜過濾,高效液相色譜法進行測定。以質量濃度x(mg/L)為橫坐標,峰面積y為縱坐標,得到線性回歸方程y=48240x+580356.9233。

1.3 數據處理

采用Origin軟件進行數據處理與繪圖,所有樣品均測量3次,取平均值并給出標準偏差。

2 結果與分析

2.1 菌種的富集分離

富集培養法是一種有效且有用的分解細菌的方法,其能夠以較高的效率分解殺蟲劑[21]。本實驗以棉花連作并常年施用二甲戊靈的土壤作為菌種來源,經過富集培養的方法,平板涂布后獲得單菌,挑取單菌平板劃線三次最后得到單菌,分離獲得20株單菌,選取生長良好的5株菌,分別命名為YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6,篩選的這5株菌進行后續的降解能力復篩。研究報告顯示,FLN-7可以降解除蟲脲[22],Aspergillussojaestrain JPDA1能夠降解久效磷[23],Paracoccussp.QCT6可降解嗪草酮[24]。Ni等發現,在二甲戊靈作為碳源的情況下,Paracoccussp.可以有效降解二甲戊靈[25]。朱魯生在二甲戊靈降解細菌HB-7的實驗證實,菌株HB-7在以高濃度二甲戊靈為唯一碳源的平板上生長良好,而且降解率高[26]。

2.2 酵母菌降解能力復篩

YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6對二甲戊靈的降解率見圖1。從圖1中可以看出,雖然本實驗篩選的5株菌均可耐受高濃度的二甲戊靈,但是在無機鹽培養基中，這5株菌對農藥的降解能力是不同的,其中酵母菌XSP6在5 d內對300 mg/L二甲戊靈的降解率為50.3%,明顯高于其他菌株,故選擇菌株XSP6做進一步研究。Ni等通過富集培養的方法分離了13株微生物,結果顯示只有三株能夠降解二甲戊靈,P13菌株能夠降解99.8%的二甲戊靈[25]。

圖1 不同菌株對二甲戊靈的降解Fig.1 Degradation of pendimethalin with different strains

2.3 菌株的鑒定結果

2.3.1 菌株的形態及生理生化特征 XSP6菌株的酵母菌形態明顯,菌落乳白色,菌體圓滑有光澤、伴有凸起且邊界整齊。通過顯微鏡對菌株形態進行觀察,發現XSP6為卵圓形,見圖2。表1詳細列出了XSP6菌株的形態及生理生化特征信息。結合形態學分析,最終確定XSP6菌株為酵母菌。

表1 形態及生理生化特征Table 1 Morphology and physiological and biochemical characteristics

圖2 XSP6的形態特征Fig.2 Morphology of XSP6

2.3.2 26S rRNA基因序列分析 測得酵母菌XSP6的26S rRNA基因序列長度為496 bp。將得到的基因序列與數據庫中的序列進行比對,獲得各序列的同源性信息,并利用Mega 5.0軟件構建系統發育樹,結果見圖3。序列比對結果表明,菌株XSP6與Candidatropicalis的26S rRNA序列相似度最高,綜合菌株的形態特征、常規生理生化特征和26S rRNA序列測定/同源性比較結果,初步鑒定酵母菌XSP6是熱帶假絲酵母。熱帶假絲酵母是一種較常見的假絲酵母,又稱熱帶念珠菌。

圖3 酵母菌XSP6的26S rRNA D1/D2基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of XSP6 basedon 26S rRNA D1/D2 gene sequence

2.4 二甲戊靈的初始濃度對酵母菌降解率的影響

二甲戊靈的初始濃度對酵母菌XSP6降解率的影響如圖4所示,酵母菌XSP6在實驗濃度范圍內對二甲戊靈降解率是隨其濃度增加而逐漸增加。胡佳月等認為,隨著培養液中二甲戊靈質量濃度的升高,降解率逐漸降低。當二甲戊靈質量濃度升至1000 mg/L時,菌株JY-2 和JY-5的降解率僅為25.87%和30.44%[27]。林愛軍等認為,二甲戊靈低質量濃度時,菌株體內的降解活性較高,有利于其降解;而達到一定質量濃度后,菌株生長受到抑制,降解率下降[28]。

圖4 二甲戊樂靈濃度對降解率的影響Fig.4 Effect of the concentration of pendimethalin on biodegradation rate

2.5 接種量對降解率的的影響

接菌量對農藥降解率的影響如圖5所示。從圖5可以看出,當接種量在1%～2.5%區間時,二甲戊靈的降解率隨著接種量的增加而增加,但是當接種量從2.5%升到5%后,降解率表現出略微下降的趨勢。推測這種現象的原因是:提高接種量可以促使菌體大量繁殖,降解能力快速增強;當接種量過多,培養體系中的營養物質匱乏,造成菌體之間在空間、營養上的競爭,導致菌體出現“早衰”,降解率降低;同時,菌體降解產生的代謝產物可能會降低微生物與二甲戊靈的接觸,也導致降解率降低。由此可知,2.5%的接種量時二甲戊靈的降解率最高。與陳婷等的研究結果相似,隨著接種量的增大,菌株B90A對六氯環己烷(hexachlotocyclohexane,HCH)的降解率也相應提高,適宜接菌量為5%[29]。

圖5 接種量對生物降解率的影響Fig.5 Effect of the inoculation quantity on biodegradation rate

2.6 蔗糖濃度對二甲戊靈降解率的影響

不同碳源濃度對農藥降解率大小的影響詳見圖6。由圖6可知,蔗糖濃度由0.5%增加至1.5%時,二甲戊靈的降解率增長迅速,當蔗糖濃度由1.5%增加至2.0%,二甲戊靈的降解率呈緩慢下降趨勢。酵母菌XSP6在蔗糖濃度2.0%時降解率最大為66.2%,表明菌株在降解二甲戊靈時有最適合的蔗糖濃度,才能發揮最佳降解效率。推測出現這種現象的原因為,無外加碳源時,細菌生長收到抑制,降解率較高[30];加入少量外加碳源能夠促進細菌的迅速增長[31]。

圖6 蔗糖濃度對生物降解率的影響Fig.6 Effect of the concentration of sucrose on biodegradation rate

蔗糖是比農藥更易被微生物利用的碳源,因此菌體對農藥的降解率變化不顯著。由此可知,降解酶的產量受到生存環境中底物的影響,它只有在合適的條件下,才可以有效降解農藥。朱魯生等發現,微生物降解農藥需要合適的外加碳源質量分數來保證細胞的正常代謝[26]。

3 結論

從棉花連作并常年施加除草劑二甲戊靈的土壤中,經富集篩選獲得YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6降解農藥的菌株,其中XSP6的降解效果最好。對XSP6進行生理生化測定和26S rRNA D1/D2區序列分析,初步鑒定其為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)。當接種量2.5%、外加碳源2%時,熱帶假絲酵母菌XSP6 5 d內對300 mg/L二甲戊靈降解率最高為66.2%。關于微生物降解酶的研究有待進一步完成。本研究篩選的酵母菌XSP6對農藥污染的水體和土壤生物修復提供了理論依據。隨著研究的深入,酵母菌在環境污染治理中的應用將會越來越廣闊。