單性木蘭葉多酚的穩定性及抗氧化性研究

鄭燕菲1,許建本1,黃秋萍1,蔡杰慧1,吳美霞1,藍亮美

(1.廣西民族師范學院化學化工學院,廣西崇左 532200;2.柳州城市職業學院機電與汽車工程系,廣西柳州 545036)

單性木蘭(MagnoliakwangsiensisFiglar & Noot.)也稱廣西木蘭,為木蘭科單性木蘭屬,成片分布僅在廣西木論自然保護區[1-2],目前廣西已進行大片的單性木蘭人工種植。單性木蘭結果率低,種子發芽率低,資源稀缺,是我國珍稀瀕危植物[3-4],于1999年被列為國家一級保護植物[5]。

目前,對單性木蘭的研究主要集中在分類學[6]、形態學[7-8]、生態學[9-10]、遺傳學[11]等方面,近年對其化學成分的研究也開始有報道。單性木蘭的揮發油含有多種名貴香料的成分[12-15];單性木蘭果實中含有多種脂肪酸,可開發作為天然保健食品[15];單性木蘭葉中多糖含量可觀,多糖組分對人肺癌細胞A549和胃癌細胞SGC7901有較好的抑制能力[16];單性木蘭葉中多酚具有良好的抗氧化活性[17]。以上文獻研究均指出單性木蘭富含多種有效成分,能開發成天然的保健藥品以及功能食品。植物中多酚具有天然無毒和良好的生物活性,已成為了醫藥領域及食品工業的研究重點之一。單性木蘭葉多酚從總抗氧化性、還原性、DPPH·的清除作用、羥基自由基(·OH)的清除作用以及抑制脂質過氧化作用五個體系中均表現出良好的抗氧化活性[18],可開發成為天然的抗氧化劑和具有保健功能的食品添加劑,但對單性木蘭葉中多酚的穩定性,以及從清除亞硝基自由基(·NO)、水楊酸法清除·OH作用該兩個體系的抗氧化性的研究鮮見報道。

本文以單性木蘭葉多酚粗提物及純化物為研究對象,針對不同加工、儲存條件下多酚物質的變化,測定其在不同光照、溫度、糖類、防腐劑、氧化還原劑條件下的穩定性,從清除·NO、水楊酸法清除·OH兩個體系考察其抗氧化活性,以期為單性木蘭多酚在工業、醫藥及食品等行業的產品開發和利用提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮單性木蘭葉 摘自廣西南寧武鳴區;單寧酸 標準品(99%純度),阿拉丁;無水碳酸鈉、蔗糖、葡萄糖、無水亞硫酸鈉 分析純,成都市科隆化學品有限公司;福林酚 分析純,上海寶曼生物科技有限公司;苯甲酸鈉 分析純,天津市光復精細化工研究所;30%過氧化氫 分析純,廣東光華科技股份有限公司。

翱藝AOE紫外可見分光光度計 翱藝儀器有限公司;SQP型電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；WP700(21)型微波爐 佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚樣品制備 單性木蘭葉多酚粗提物及純化物按文獻[17-18]進行制備。新鮮單性木蘭葉粉末用石油醚進行脫脂、除色處理,加入液固比21∶1 mL/g的70%丙酮水溶液,在溫度65 ℃、提取時間16 min的微波提取條件下進行提取,2400 r/min離心 10 min、濃縮、55 ℃鼓風干燥至恒重,制得單性木蘭葉多酚粗提物,其質量含量為11.69%。將濃縮后的單性木蘭葉多酚粗提液依次用石油醚、乙酸乙酯進行多次萃取,乙酸乙酯層減壓濃縮、55 ℃鼓風干燥至恒重,得單性木蘭葉多酚純化物,其質量含量為32.11%。

1.2.2 多酚含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 配制質量濃度為0.5 μg/mL的單寧酸標準液,分別移取0.1、1.1、2.1、3.1、4.1 mL標準液于25 mL棕色容量瓶中,分別加入1.3 mL福林酚溶液,搖勻靜置6 min,再分別加入5 mL飽和碳酸鈉溶液,搖勻后靜置6 min,定容至25 mL后搖勻靜置30 min,于760 nm處測量吸光度[19-20],繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣液多酚含量測定 準確移取一定體積的多酚樣液,用標準曲線制作的顯色法測定其在760 nm處的吸光值,計算單性木蘭葉多酚的含量[18]。

1.2.3 多酚穩定性的測定

1.2.3.1 光照對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 取25 mL 0.0142 μg/mL的單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于25 mL容量瓶中,分別在避光、未避光(室內自然光)條件下靜置,每隔1 h取樣1次[21],共取樣5次,顯色后于760 nm處測吸光度,實驗平行3次,取平均值。

保留率計算公式[22]如下:

式中:ρ為處理后的單性木蘭葉多酚的含量,μg/mL;ρ0為處理前的單性木蘭葉多酚的含量,μg/mL。

1.2.3.2 溫度對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 取25 mL 0.0142 μg/mL的單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于25 mL容量瓶中,分別在30、50、70、90、100 ℃的條件下避光靜置,每隔1 h取樣1次[23],共取樣5次,顯色后于760 nm處測吸光度,實驗平行3次,計算保留率。

1.2.3.3 糖類對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 取5 mL 0.0142 μg/mL的單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于25 mL容量瓶中,分別用濃度為10、20、30、40、50 g/mL的葡萄糖溶液或蔗糖溶液定容至刻度線[24],搖勻后在30 ℃條件下避光靜置8 h,顯色后于760 nm處測吸光度,實驗平行3次,計算保留率。

1.2.3.4 苯甲酸鈉對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 取5 mL 0.0142 μg/mL的單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于25 mL容量瓶中,分別用濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.15 g/mL的苯甲酸鈉溶液定容至刻度線[22],搖勻后于30 ℃條件下避光靜置8 h,顯色后于760 nm處測吸光度,實驗平行3次,計算保留率。

1.2.3.5 氧化還原劑對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 取5 mL 0.0142 μg/mL單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于25 mL容量瓶中,分別用濃度為0、0.50、1.00、1.50、2.00 g/mL的過氧化氫溶液、亞硫酸鈉溶液[25],搖勻后于30 ℃條件下避光靜置5 h,顯色后于760 nm處測吸光度,實驗平行3次,計算保留率。

1.2.4 多酚抗氧化性的測定

1.2.4.1 單性木蘭葉多酚對·NO的影響 分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的0.1 μg/L單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于10 mL棕色容量瓶中,各加入2.0 mL的 10 μg/mL亞硝酸鈉溶液,避光靜置10 min,加入2.0 mL的 4 g/L對氨基苯磺酸溶液,搖勻反應5 min,再加入1.0 mL的 2 g/L鹽酸萘乙二胺,定容至10 mL,搖勻,15 min后于紫外分光光度計測定,讀取波長為540 nm處的吸光度A1,其中不加亞硝酸鈉溶液時的吸光度為A2。

在上述實驗中加入亞硝酸鈉溶液前用蒸餾水代替多酚溶液作空白,測定吸光度A0[26]。實驗平行3次,取平均值。單性木蘭葉多酚對·NO的清除率按下式計算：

式中:A0為未加入樣品溶液的吸光度,A1為加入樣品溶液后的吸光度,A2為未加入亞硝酸鈉時的吸光度。

1.2.4.2 單性木蘭葉多酚對·OH的影響 參照文獻[27]的方法并略作修改,分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的0.1 μg/L單性木蘭葉多酚粗提物、純化物溶液于10 mL棕色容量瓶中,依次加入2.0 mL 的6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2.0 mL 的6 mmol/L過氧化氫溶液,搖勻避光靜置10 min,再加入2.0 mL的 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液,定容至10 mL,混勻,靜置30 min后分別測定在510 nm處的吸光度Ai,其中不加水楊酸溶液時的吸光度為Aj。

在上述實驗中用蒸餾水代替多酚溶液作空白,測定吸光度A0。實驗平行3次,取平均值。單性木蘭葉多酚對·OH的清除率按下式計算：

式中:A0為未加入樣品溶液的吸光度,Ai為加入樣品溶液后的吸光度,Aj為未加入水楊酸時的吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗均進行3次重復,試驗數據處理和分析采用Origin 9.1軟件。

2 結果與分析

2.1 單寧酸標準曲線的繪制

以單寧酸標準液質量濃度(x)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標,繪制標準曲線,如圖1所示。得到的單寧酸標準曲線的線性回歸方程為y=3.284x+0.0461,R2=0.9996,說明單寧酸濃度在0.0020～0.0820 μg/mL范圍內于波長760 nm處吸光值與濃度的線性關系良好。

圖1 單寧酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tannins

2.2 多酚的穩定性研究

2.2.1 光照對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 不同光照對單性木蘭葉多酚樣品穩定性的影響結果如圖2所示。

圖2 光照對單性木蘭葉多酚穩定性的影響Fig.2 Effect of light intensity on the stability of polyphenols from M. kwangsiensis leaves

由圖2可知,不同光照條件下,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率隨著時間的增加均呈下降趨勢,且純化物的保留率高于粗提物的保留率。單性木蘭葉多酚粗提物和純化物在避光1 h時保留率分別達53.75%、57.50%,在未避光相同條件下單性木蘭葉多酚樣品的保留率較避光條件的保留率低,分別為41.48%、47.69%。在避光5 h時,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物保留率分別達23.00%、29.60%,在未避光相同條件下保留率較避光條件的保留率低,分別為4.36%、23.21%。這是因為未避光條件下,多酚物質中的不飽和鍵會在光的條件下加速降解[22]。因此,單性木蘭多葉酚在長時間生產使用過程中應選擇避光處理與保存。

2.2.2 溫度對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 不同溫度對單性木蘭葉多酚穩定性的影響結果如圖3、圖4所示。

圖3 溫度對單性木蘭葉多酚粗提物穩定性的影響Fig.3 Effects of temperatures on the stability of crude polyphenols from M. kwangsiensis leaves

圖4 溫度對單性木蘭葉多酚純化物穩定性的影響Fig.4 Effects of temperatures on the stability of the purified polyphenols from M. kwangsiensis leaves

由圖3～圖4可知,隨著實驗溫度的增加,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率均呈下降趨勢,純化物的保留率均高于粗提物的保留率。單性木蘭葉多酚粗提物和純化物在30 ℃、1 h的保留率分別達54.30%、81.58%;100 ℃下靜置5 h時,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的穩定性最差,保留率在10%左右,這是因為植物多酚在長時間高溫環境下,會受熱發生反應生成其他物質[23]。單性木蘭葉多酚需要長時間貯存時應該置于低溫的環境中,避免因熱造成結構的改變。

2.2.3 糖類對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 不同濃度的不同糖類物質對單性木蘭葉多酚穩定性的影響結果如圖5所示。

圖5 糖類對單性木蘭葉多酚穩定性的影響Fig.5 Effects of different sugars on the stability of polyphenols from M. kwangsiensis leaves

由圖5可知,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率均隨葡萄糖濃度和蔗糖濃度的增加而增加,即糖類對多酚的穩定性有一定的增強作用。這是由于隨著糖類濃度的增加,溶液中水分活度逐漸降低,從而抑制了多酚的降解[22]。在各相同糖濃度下,葡萄糖環境中的保留率低于在蔗糖環境中的保留率。這是因為葡萄糖有著活潑的化學性質,其可使得多酚物質結構發生變化。所以在單性木蘭葉多酚作為食品和藥品時的生產及加工中,選擇共用的糖類物質應為蔗糖,利于多酚的穩定。

2.2.4 苯甲酸鈉對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 不同濃度的苯甲酸鈉對單性木蘭葉多酚穩定性的影響情況如圖6所示。

圖6 苯甲酸鈉對單性木蘭葉多酚穩定性的影響Fig.6 Effect of sodium benzoate on the stability of polyphenols from M. kwangsiensis leaves

由圖6可知,隨著苯甲酸鈉質量濃度的增加,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率逐漸增大,粗提物的保留率高于純化物的保留率。對單性木蘭葉多酚樣品的保留率(y)和苯甲酸鈉質量濃度(x)進行線性擬合,結果如表1,由表中R2可看出,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率和苯甲酸鈉質量濃度間存在良好的線性關系。單性木蘭葉多酚的穩定性與防腐劑苯甲酸鈉濃度呈正相關,防腐劑可減少多酚的降解。

表1 苯甲酸鈉中保留率與質量濃度的相關性Table 1 Relations between retention rate(y)and mass concentration(x)of sodium benzoate

2.2.5 氧化還原劑對單性木蘭葉多酚穩定性的影響 不同的氧化還原劑對單性木蘭葉多酚穩定性的影響結果如圖7所示。

圖7 氧化還原劑對單性木蘭葉多酚穩定性的影響Fig.7 Effects of oxidative reductant on the stability of polyphenols from M. kwangsiensis leaves

由圖7可知,隨著氧化劑過氧化氫和還原劑亞硫酸鈉濃度的增加,單性木蘭葉多酚粗提物和純化物的保留率逐漸下降,粗提物的保留率比純化物的保留率低,這說明氧化劑過氧化氫和還原劑亞硫酸鈉對單性木蘭葉多酚均具有破壞性。在各相同濃度時,氧化劑過氧化氫對單性木蘭葉多酚的破壞性強于還原劑亞硫酸鈉的破壞性,這是植物多酚易被氧化所引起。

2.3 多酚的抗氧化性研究

2.3.1 單性木蘭葉多酚對·NO的清除作用 單性木蘭葉多酚對·NO的清除作用結果如圖8所示。

圖8 單性木蘭葉多酚清除·NO的作用Fig.8 Effect of M. kwangsiensisleaves polyphenols on removing·NO

由圖8可以看出,在濃度范圍0.01～0.05 μg/L內,單性木蘭葉多酚樣品對·NO具有清除作用,且對·NO的清除率隨著樣品濃度的增加而增加。當樣品濃度小于0.03 μg/L時,單性木蘭葉多酚粗提樣對·NO的清除率強于純化樣;當樣品濃度大于0.03 μg/L時,單性木蘭葉多酚純化樣對·NO的清除率強于粗提樣,其原因可能是較低濃度下,粗樣中的雜質對·NO的清除作用影響較小,隨著濃度的增加雜質增多,雜質對·NO的清除作用影響明顯。在所測濃度范圍內,對清除率(y)和質量濃度(x)進行線性擬合,結果如表2所示,由R2可知,粗提樣和純化樣對·NO的清除率與樣液濃度存在較好的線性關系。

表2 清除·NO作用中清除率與濃度的相關性Table 2 Relations between scavenging rate(y)and mass concentration(x)of removing ·NO

2.3.2 單性木蘭葉多酚對·OH的清除作用 單性木蘭葉多酚對·OH的清除作用結果如圖9所示。

圖9 單性木蘭葉多酚清除·OH的作用Fig.9 Effect of M. kwangsiensis leaves polyphenols on removing ·OH

由圖9可知,在濃度范圍0.01～0.05 μg/L內,單性木蘭葉多酚樣品對·OH的清除作用隨著樣品濃度的增加呈上升趨勢,與樣品濃度呈正相關關系。當樣品濃度大于0. 02 μg/L時,單性木蘭葉多酚粗提樣對·OH的清除率明顯強于純化樣。所測濃度范圍內,對清除率(y)和質量濃度(x)進行線性擬合,結果如表3所示,由R2可知,粗提樣和純化樣對·OH的清除率與樣液濃度存在較好的線性關系。

表3 清除·OH作用中清除率與濃度的相關性Table 3 Relations between scavenging rate(y)and mass concentration(x)of removing ·OH

3 結論

本試驗對單性木蘭葉中多酚的穩定性和抗氧化性進行了考察,結果顯示:多酚在避光條件下較未避光下穩定,長時間貯存時應該置于低溫的環境中,且在蔗糖環境較穩定;添加防腐劑苯甲酸鈉有利于單性木蘭葉多酚的穩定,且其穩定性與苯甲酸鈉的質量濃度呈良好的線性關系;氧化劑過氧化氫和還原劑亞硫酸鈉對單性木蘭葉多酚均具有破壞性,且過氧化氫對其破壞性更強。在濃度范圍0.01～0.05 μg/L內,多酚對·NO和·OH具有較好的清除作用,其清除作用隨樣品濃度的增大而增強,且清除作用的量效關系具有較好的線性關系。

本文尚未能對單性木蘭葉中多酚粗提物和純化物兩者各條件下穩定性存在差異進行說明,此后應就該問題進行探究。結果可為單性木蘭在食品、藥品和保健品等方面的應用提供重要依據,為單性木蘭其他的天然成分林產品的開發和利用奠定一定的基礎。